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(無題) 削除/引用 No.551-7 - 2012/05/29 (火) 08:02:33 - 組織 トリミングができるならそれが無難でしょうね。 細かい話ですが、今回のケースは手技的な問題の可能性が高いですので、細胞傷害ではなく、artifactと表現した方が正確かと思います。細胞傷害というと、生前に何か処置をしたことで空胞ができたイメージを与えてしまいますので。 あと7週齢ラットの脳だと、postnatal developmentが終わりつつある段階ですので、厳密にはadultではないとみなす人もいるかもしれません。このあたりの解釈は関連分野によっても変わってくるかと思います。

ラット脳免疫染色 削除/引用 No.551-6 - 2012/05/29 (火) 00:49:47 - 凜子 みなさま有用なご意見とご指摘ありがとうございます。 やはり空胞は細胞傷害の結果できてしまっているのですね・・・ ラットは７週齢adultです。やはり大きいのでトリミングなどして対応してみたいと思います。 また、コンパウンドの包埋方法も液体窒素を用いていましたが、 次回からゆっくりの冷却を試してみます。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.551-5 - 2012/05/24 (木) 19:44:18 - AA コンパウンドへの包埋の際はどのように冷却されていますでしょうか？ 一般に、冷却を迅速に行なったほうが氷晶の形成が抑えられるといわれています。 が、個人的にはこれとは逆の経験をしております。 私のやり方はスクロース置換のあと、コンパウンドになじませて沈めたものを ドライアイスの上に直接置いて、そのまま全体が凍るまで2,30分程度放置します。 アセトンやイソペンタン、液体窒素などは使用せずに底面からの熱伝導だけで固めていますが、 この方法のほうが空胞ができたりということは起きにくいです。 理屈の上では急速に凍らせるほうが良いのだろうとは思います。 コンパウンドと組織の融点の差か、熱伝導率の差かわかりませんが、 私自身としてはスクロースへの置換が十分行われているならば、 むしろゆっくり凍らせた方が全体が均一に凍結していくのだと考えています。

(無題) 削除/引用 No.551-4 - 2012/05/24 (木) 09:48:37 - 組織 ラットはadultでしょうか？固定液やショ糖液の浸透が悪いのかもしれませんね。特にホルマリンは室温で1晩浸漬しても5mm程度しか浸透しないので、whole brainだと十分に浸透しているか気になるところです。解析に支障がなければ、固定前にスライスしておいてはいかがでしょうか。 あとPFAの緩衝液はPBSよりもPB（リン酸緩衝液）の方が形態保持能が高いと考えられています。直接比べた訳ではないのですが、形態学の専門家にとってはPBが一般的かと思います。

(無題) 削除/引用 No.551-3 - 2012/05/24 (木) 08:52:41 - ~ サイズが大きいために固定かスクロース浸透がうまくいっていないのかもしれません。 かん流が出来ないのでしたら、一度、見たい部分をトリミングしてから固定に入ってみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.551-2 - 2012/05/23 (水) 23:11:25 - ｐｋ スクロース処理は、凍結時の氷晶による組織傷害を防ぐ目的だと理解しています。スクロースの浸透が悪いのかもしれませんので、10%→20%→30%と段階的に上げていってはどうでしょうか。

ラット脳免疫染色 削除/引用 No.551-1 - 2012/05/23 (水) 13:15:30 - 凛子 ラット脳をhole brainで取り出し 浸透固定（4%PFA in PBS）で2日間、その後約４日〜６日（組織が沈むまで）30%シュークロースで置換し、クライオスタットで薄切しています。 潅流固定は行っておりません。 以前潅流固定でマウス脳を染めていたときは問題なかったのですが、 ラット脳で以上の操作で染色すると 脳内に液胞状の空洞が部位によって多数できてしまいます。 （標的細胞自体は染まっています） 氷による細胞障害かとも思いましたが、 置換はできていて、また、コンパウンドになじませる方法も試しましたが効果は見られませんでした。 何か原因や問題点など気になった所を ご指摘して頂ければ嬉しいです。 未熟な質問で申し訳ありませんが よろしくおねがいします。

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