BioTechnicalフォーラム [培養液作製時の白濁・沈殿物]

培養液作製時の白濁・沈殿物

No.550-TOPIC - 2012/05/23 (水) 03:12:24 - 見習い

こんにちは。
培養液の作製時のトラブルについてなのですが、
私の研究室では、PB1という培地を試薬から
以下の手順で調製して使用しています。

NaCl　 4000mg
KCl　　 100mg
CaCl2　 60mg
KH2PO4　 100mg
MgCl2・6H2O　 50mg
Na2HPO4　 575mg
Na-Pyruvate　 18mg
Glucose　 500mg
Penicillin　 37.5mg
BSA　 1500mg
---------------------
(in D.W 500ml)

これらの試薬を上から順にDWに溶かしていきます。

その途中でMgCl2・6H2Oを溶解させた後、Na2HPO4を溶解させるのですが、
この時に何度やっても溶液が白濁し、沈殿物を生じさせてしまいます。

おそらくリン酸塩が沈殿しているものと思われるのですが、
これを生じさせないためにはどうしたら良いでしょうか？

ちなみに私はこれらの試薬をD.W500mlに順番に直接溶解させるのではなく、
50mlチューブにおよそ30mlD.Wを入れて、それに全部溶かし終えてから、
残りのD.Wに加えて使用しています。

この手順がそもそもダメなのでしょうか？
また試薬をこの順番に溶解させるのがダメで、順番を入れ替えたら
沈殿しないことはあるのでしょうか？

何が原因か分からず、また文章もまとまっていないおらず
お見苦しいですが、本当に困っているのでどうかご教授よろしくお願いします。
　

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No.550-6 - 2012/05/23 (水) 20:19:45 - 見習い

> 通常Caは最後にx100ストックを入れると思いますよ。

そうなのですか。知りませんでした。
貴重な情報ありがとうございます。
早速今から再度培地調製してみます！

> 改良するとしたら、DDWを30mlほど取って、CaCl2＋MgCl2を溶かす。
> 残りのボトルに残りの試薬を全て投入し溶かす。Ca・Mg溶液を戻す。

なるほど。分かりました。
参考にさせていただきます。

皆様のご意見やご指摘から以下の点に気を付けて調整しようと思います。
1.30mlほどのD.W取って、CaCl2を溶解(Stock1としておきます)
2.残りの試薬を上から順にボトルに溶解
3.血清を入れる前に、Stock1をボトルに少量ずつ溶解

(無題)

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No.550-5 - 2012/05/23 (水) 18:52:53 - Flow-Joe

挽きたての方法でも大丈夫でしょうが、通常Caは最後にx100ストックを入れると思いますよ。

(無題)

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No.550-4 - 2012/05/23 (水) 14:08:06 - 挽きたて

加えている量が少ないので、メスアップは不要でしょう。
沈殿はCaPO4でしょうね。
改良するとしたら、DDWを30mlほど取って、CaCl2＋MgCl2を溶かす。
残りのボトルに残りの試薬を全て投入し溶かす。Ca・Mg溶液を戻す。
で、大丈夫だと思います。
D-PBS(+)を作製するときに、100xCa/Mgを添加して作製しますので。
（ただし、数日で沈殿が生じます）
念のため、BSA・Na-Pyruvate・Penicillinなしで通常のDWでお試しください。

(無題)

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No.550-3 - 2012/05/23 (水) 13:18:12 - 見習い

> これはどういうことでしょうか？
> 30 mlにすべての試薬を溶かしてから470 mlくらいの水と混ぜているのか、それぞれの試薬を30mlずつの水に溶かしてから混ぜているのか。
>
> 前者であれば沈殿が生じるのは当然です。
> 後者であれば、CaCl2かNa2HPO4を最後に少しずつ加えれば解消できるはずです（加えた直後は白濁するのでそれがなくなってからさらに添加を繰り返す）。
> そもそもメスアップはしないのですか？

研究室でのやり方が前者の調整法で教わっていたのですが、何度やっても沈殿物が出てくるので（当たり前ですよね；）、私は調整法を変えて、後者で現在行っています。分かりづらくてすみませんでした。
それから、この後者の調整法ですと、50mlチューブを10本程毎回使用するので、もったいないと感じて、50mlチューブに適量DWを入れ、NaCl添加・混和→500mlボトルに戻す・混和→再度ボトルからチューブにDW入れる→KCl添加・混合→…（以下同様）のやり方でやろうかと思っているのですが、この調整法は問題あるでしょうか？

また、Na2HPO4を添加する時、少量ずつ添加していませんでした。
これが原因かもしれませんね、再度作製してみようと思います。

メスアップはしていません。
業者から滅菌水（500ml/bottle)を購入していて、ちょうど500mlだからメスアップしなくてもいいよと引き継ぎました…。
メスアップ必要でしょうか？

(無題)

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No.550-2 - 2012/05/23 (水) 05:47:14 - ab

> ちなみに私はこれらの試薬をD.W500mlに順番に直接溶解させるのではなく、
> 50mlチューブにおよそ30mlD.Wを入れて、それに全部溶かし終えてから、
> 残りのD.Wに加えて使用しています。

これはどういうことでしょうか？
30 mlにすべての試薬を溶かしてから470 mlくらいの水と混ぜているのか、それぞれの試薬を30mlずつの水に溶かしてから混ぜているのか。

前者であれば沈殿が生じるのは当然です。
後者であれば、CaCl2かNa2HPO4を最後に少しずつ加えれば解消できるはずです（加えた直後は白濁するのでそれがなくなってからさらに添加を繰り返す）。
そもそもメスアップはしないのですか？

培養液作製時の白濁・沈殿物

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No.550-1 - 2012/05/23 (水) 03:12:24 - 見習い

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