GPCRを無細胞蛋白質合成系で合成し、アゾレクチンリポソーム膜内にフォールディングされたものの機能評価を行っていますが、
Sansuk, Kamonchanok, et al. "GPCR proteomics: mass spectrometric and functional analysis of histamine H 1 receptor after baculovirus-driven and in vitro cell free expression." Journal of proteome research 7.2 (2008): 621-629.
を参考にした方法では、リポソーム膜内に入ってくれるGPCRの率が非常に悪くて困っています。
具体的には、無細胞蛋白質合成系でGPCRを合成し、精製後、受容体蛋白 訳約0.
2mgに対してアゾレクチンリポソーム6mg を添加し２％DDMを含むbis tris propane bufferを400uL加えて、4℃ 4時間ローテートさせた後に、20,000xgで遠心分離。ミセルを含む上清を採取後、bioradのbio beads SM-2を200mgと混ぜて4℃ over nightローテートします。
かなり濁ってきた液体を採取し、空のリポソームと、膜蛋白が入ったリポソームを分離するためにスクロース密度勾配遠心分離を行うと、上層に空のリポソームと思われる濃いバンドが見られるのですが、下層に見られるはずのGPCRが入ったプロテオリポソームのバンドが非常に薄くて、うまく膜内に入っていないと考えています。実際に、デングラ後の最上層のOD280をみると、かなりの蛋白が残っているようで、これもまたうまく膜内に移行できなかった証拠ではないかと考えています。
リポソーム膜内に取り込まれるGPCRの量を増やしたいのですが、bio beadsを用いたプロテオリポソームの再構築をされた方がいらっしゃいましたら、気を付ける点などをお教えいただけると幸いです。
よろしくお願いいたします。
|
|
このスレッドをはてなブックマークに追加