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(無題) 削除/引用 No.5455-33 - 2016/10/29 (土) 03:54:25 - おお >たGST-融合タンパク質を50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione, pH 8.0で溶出し、 reduced glutathioneがどれくらいpHにインパクトがあるかわかりませんが、それがクリアーならTrisの濃度は思いっきり下げれると思います（５mMあたりとか）。すでにサンプルのpHは安定化されているのでそれをキープするだけですから。 前に示したリンクでは１００mMぐらいのTRISでも結合がしっかりしていれば大丈夫っぽいですけどね。まあでもなるだけ避けるともかいてある・

(無題) 削除/引用 No.5455-32 - 2016/10/28 (金) 19:38:02 - WInter-8 私の場合、GST columnの溶出画分の純度が低くて量も多いので（ダラダラと溶出する）、他のカラムをもう一本かけてからプロテアーゼ処理をしています。 >あと溶出バッファが50 mM Trisなので、これではどのみちニッケルカラムとは相性が悪いのでバッファ交換必要ですよね？経験のある方がいましたら教えてください。 TrisでNi精製しています。HisTrap, Ni-NTA共にTrisが問題になったという話は周りでは聞きません。

(無題) 削除/引用 No.5455-31 - 2016/10/28 (金) 15:04:26 - あのさあ GSTって切らないかんの？

(無題) 削除/引用 No.5455-30 - 2016/10/28 (金) 01:03:22 - おお バッファー交換が必要とまで言えませんが、各社マニュアルなどを見ていると10 mM reduced glutathione １０〜３０mMでうまくいく例はあるようです（会社によって上限がちがいます）。TRISも相性的にはいいとは言えませんが実際使われていることもあります。最初からリン酸バッファーを使えばバッファーの方は解決するんじゃないでしょうか。 両者とも懸念にはなりますので、手元にそういうサンプルがあれば、透析をかますとか、ゲルろ過するかもしれませんし、Niカラムを使わずにイオン交換などで精製するかもしれません。 wolfson.huji.ac.il/purification/PDF/Tag_Protein_Purification/Ni-NTA/AMERSHAM_HisTrapHP_Instruct.pdf page 4 biontex.com/con_4_6_4/cms/upload/pdf/Compatibilitytable%20Ni-NTA_en.pdf page 2

(無題) 削除/引用 No.5455-29 - 2016/10/27 (木) 22:59:38 - う 横から失礼します。 私も今GSTとMBP fusion proteinを精製しようかと考えているところです。 特に還元型Glutathioneで溶出した後に、トロンビン処理し、更にニッケルカラムで目的のタンパクを精製したいんですが、グルタチオンを脱塩で除かずそのままトロンビン処理していんでしょうか？ あと溶出バッファが50 mM Trisなので、これではどのみちニッケルカラムとは相性が悪いのでバッファ交換必要ですよね？経験のある方がいましたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.5455-28 - 2016/10/27 (木) 15:07:47 - おお 情報ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5455-27 - 2016/10/27 (木) 13:33:41 - 初学者 トピ主です。今回、状況を打開できそうなので、シェアさせていただけたらと思います。 （これまでの問題点） 論文にならい、BL21にGST-融合タンパク質をIPTG (最小濃度 0.3 mM)で15度、Over nightで誘導すると全てが不溶性画分に来てしまった。不溶性画分からの精製には8 M尿素を使い、徐々に透析することでrefoldを期待したが、アグってしまい、精製を断念してしまった。 （今回の変更点） BL21からJM109に種を変え、条件検討をやり直しました。 その結果、IPTG存在下（最小濃度0.3 mMまで試しました）では封入体に発現してしまったが、むしろIPTG無しで15度、Over night cultureさせただけの可溶性画分に、欲しいタンパク質が発現していることに気づきました。 今、IPTGを0.3 mMから更に減らして条件検討をしており、どのIPTG濃度が最も可溶性タンパク質を増やすかを検討しているところです。 が、それと並行で、IPTG無しで恒常的に発現している目的のタンパク質をグルタチオンビーズで精製したところ、これで本当にうまくいきまして、大腸菌culture 100 mlから20 - 60 ugほどの目的タンパク質を精製することができました。 これは本当に嬉しかったです。 今は超最小濃度のIPTGが可溶性のタンパク質を増やすのではないかと期待してラストの条件検討をしていますが、それがうまくいかなければ、もうIPTG無しで5 Lほど培養し、そこから1 mgほどを力技で精製できるのでは・・！と期待しています。 皆様、たくさんのコメントをいただき、まことにありがとうございました。 タンパク質精製素人の私の情報が皆様の参考になるかはわかりませんが、シェアさせていただきました。

(無題) 削除/引用 No.5455-26 - 2016/10/27 (木) 13:23:30 - 初学者 > 沈殿を除いてみて、GSTタンパク質が溶けているようなら、試したら良いんじゃないでしょうか。 Winter-8様、返信いただけていたことに今気づきました。ありがとうございました。 はい、結局、透析時に沈殿してしまったモノに目的のタンパク質が含まれておりました。遠心した上清には目的のモノは含まれていませんでした。 おお様、ありがとうございます。 やはりアルギニンは加えるべきなんですね。当時、ラボにありませんでしたので、加えることができませんでした。 あのさあ様、ありがとうございます。 今、JM109に変えて、発現させてみました。それについては次のレスにてシェアさせていただきたいと思っています。 AP様、ありがとうございます。 タンパク質発現の目的は、目的タンパク質を活性を保持させたまま、発現精製することです。 今回、JM 109に切り替えて行ってみました。それに関しては次のレスにはシェアさせていただきます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5455-25 - 2016/10/14 (金) 18:15:13 - SK 封入体から精製するのであれば片山化学工業が出している TAPS-Sulfonateというのも使えそうですよ

(無題) 削除/引用 No.5455-24 - 2016/10/14 (金) 15:46:33 - AP 封入体はその80%以上が発現誘導したタンパク質だそうですから、精製だけが目的であれば、封入体をきれいにしていくとう行き方もあります。何がなんでもアフィニティーカラムがサイコーって訳でもないですから。 ・封入体をTriton X-100などで洗って可溶性の不純物を除き、目的のタンパク質を不溶性沈殿として残す。 ・変性可溶化した封入体を透析したりしたときにでてくる不溶化沈殿が純度の高い目的タンパク質から出来ているかも（硫安沈殿の差次的沈殿でタンパク質を分画するように）。 >全部読んでないけどPGEXベクターってJM109で発現するのか？ するよ。単純なLacPの発現系だからね。青白選択ができる宿主ならLacPの発現が誘導できるんだから、pGEXのプロモーターが働かない理由がないよね。プロテアーゼ欠損を持たないというところで、タンパク質発現用宿主の第一選択にならないけれど。JM109に切り替えることがなにかしらの役に立つかは知らないけど。

(無題) 削除/引用 No.5455-23 - 2016/10/14 (金) 15:00:07 - あのさあ 全部読んでないけどPGEXベクターってJM109で発現するのか？まずはそこきちんと調べておいたほうがいいかもよ

(無題) 削除/引用 No.5455-22 - 2016/10/14 (金) 14:55:21 - おお どつぼにはまりやすいのはたしかですね。最初の尿素で溶けなかったものは、ペレットにしたあと更に尿素で抽出するとか言うてもありそうです。 フレンチプレスとかであれば粒子を粉々にするのでより可溶化できるはずです。または超音波か。 バッファーにアルギニンなど１００mMぐらい入れることでアグリ悪くなったりするという話も聞きます。透析のときにTX100を加えておくのもありかもしれません（もし加えてなかったら）。

(無題) 削除/引用 No.5455-21 - 2016/10/14 (金) 11:30:17 - WInter-8 > 今朝、漸く1Mまで来ましたが、透析膜を除くと不溶性のモヤモヤが沢山できていました。。。 > これが所謂、タンパク質凝集ということでしょうか。。。。。 > なんだかどつぼにはまりそうです。 > やはり封入体からのタンパク質精製は素人には厳しそうです。。。 どつぼにはまりやすいですし、絶対にうまくいく方法でもないです。 素人とかは関係なく、サンプルに依存するものだと思います。 > もし今透析中のGSTタンパク質を含む溶液からグルタチオンビーズに持って行き、そこから精製可能でありましたら挑戦してみたいとは思っていますが、いかがでしょうか？ 沈殿を除いてみて、GSTタンパク質が溶けているようなら、試したら良いんじゃないでしょうか。 精製可能かどうかはやってみないとわかりません。

(無題) 削除/引用 No.5455-20 - 2016/10/14 (金) 10:11:46 - 初学者 8M尿素にて可溶化したタンパク質を透析膜に入れ、約一時間置きに10％の透析液を交換するということをしてきました。 終濃度=8 x0.9^n (n=時間) 今朝、漸く1Mまで来ましたが、透析膜を除くと不溶性のモヤモヤが沢山できていました。。。 これが所謂、タンパク質凝集ということでしょうか。。。。。 なんだかどつぼにはまりそうです。 やはり封入体からのタンパク質精製は素人には厳しそうです。。。 手っ取り早くできる、大腸菌をJM109に替えてみる、ベクター（タグも）を替えてみることを試してみたいと思います。 もし今透析中のGSTタンパク質を含む溶液からグルタチオンビーズに持って行き、そこから精製可能でありましたら挑戦してみたいとは思っていますが、いかがでしょうか？ 沢山質問してしまい、大変恐縮しています。

(無題) 削除/引用 No.5455-19 - 2016/10/13 (木) 11:27:37 - 初学者 現在、ダメ元で不溶性画分を8M尿素 in PBSで可溶化した後、徐々に尿素濃度を下げて行く方法で透析を試みています。0.1Mアルギニンが凝集阻害に働くとのことですが、ラボにありませんでしたので、まずは段階的な透析のみでバッファー交換およびリフォールドに挑戦中です。 またアップデートさせてください。 ちなみに80mLのLB培養液由来のペレットを可溶化し、封入体を分離し、それを洗浄後、10mLの8M尿素で封入体を可溶化していますが、尿素を加え、ソニケーションを行ったにも関わらず遠心後ペレットが一回り小さいですが、生じました。ということは8M尿素でも可溶化したなかったものがあるということですよね。これにはとても驚きました。

(無題) 削除/引用 No.5455-18 - 2016/10/13 (木) 11:21:23 - 初学者 WInter-8様有り難う御座います。 目的タンパク質内にはジスルフィド結合は無いことになっています。 が、大腸菌内ではどうかはわかりません。 ClontechからpColdーTFというベクターがあるのですね。 経済的な状況から購入は今のところ難しそうです。 ですが、やはりシャペロンとの共発現のシステムなので、可溶性で問題が起こる際にはやはりフォールディングを促す工夫をするという流れが見えてきました。エタノール処理でヒートショックを期待してみましたが、それでは変わりませんでした。 WInter-8、レスいただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5455-17 - 2016/10/13 (木) 11:15:38 - 初学者 AP様有り難う御座います。 > 目的のタンパク質が割と小さい場合は、親水性の大きめのタグと融合すると可溶性発現できる場合もあります。GSTはその選択肢のひとつですが、それでダメだったならMBPとか、 そうですよね。条件検討を山のようにしたところで可溶性発現が期待できるわけではないというのはごもっともです。というかいよいよそのように感じてきました。 > 目的のタンパク質が割と小さい場合は、親水性の大きめのタグと融合すると可溶性発現できる場合もあります。GSTはその選択肢のひとつですが、それでダメだったならMBPとか、 目的のタンパクは30kDほどです。 GSTの方がよっぽど大きいですし、単体で発現させたら案外うまくいくかもしれないなと期待はしています。。ただ目的のタンパク質のみを発現させるプラスミドがないのが痛いところです。 今は、バキュロの系も考えていますが、セルフリーというのもあるのですね。 一度調べてみますが、現状ではもう少し大腸菌で工夫次第で壁を乗り越えられたらと思っています。 AP様、レスをいただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5455-16 - 2016/10/13 (木) 11:10:02 - 初学者 初学者です。 おおさん、この度はレスいただき有り難う御座います。 当初25度で行っていましたが、19度にしてもほとんど全てが封入体に行ってしまいました。 昨日可溶性画分にわずかに行ってるものをグルタチオンビーズで落としてみて精製可能か調べてみましたが、CBBでは何も見えませんでした。ビーズとの結合は50mMトリス（pH8）に1mM　DTTを加えて4度、ローテーションさせていました。 また、ヒートショックを与えるために3％ほどのエタノールを加えても、全体的な発現量が減るだけで可溶性画分への移行は変わり有りませんでした。 先行論文ではGSTを付けず、目的のタンパク質（30kD）のみをTG1大腸菌に発現させており、可溶性画分から精製しています。ただ、私のラボと周りのラボにはGST融合用のものしかなく、目的のタンパク質だけを発現させるようなプラスミドがないことが致命的です。 私の周りにはpGEX4T2しかありません。 ボスの奥さんのラボでpET vectorがあり、N末にヒスが来るようです。ですが、GSTに比べこのヒスタグは圧倒的に小さいので、もしかしたら先行者のように可溶性画分に来てくれるのではと期待しています。。 > GSTであればちょっと強めの界面活性剤でサルコシルでもある程度以下の濃度ではGSTが変性せずにファンクショナルなので、一部の研究者たちの間ではポピュラーなようです。 サルコシルというのはリフォールドの際に用いるものだと思っていました。ポピュラーなのですね。一度今出来る範囲での条件検討が終われば、サルコシルにも取りかかってみたいと思います。 > 大腸菌は色々バリエーションがあり選択しがありますが、、、どうかなぁと。。。 隣りのラボがJM109があるようです。pGEX4T2でもIPTGで発現するようなので、一度挑戦させていただこうと思っています。ただプロテアーゼ欠損株ではないということには注意しておこうと思っています。 おお様、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5455-15 - 2016/10/13 (木) 02:07:58 - WInter-8 うさぎ由来ですと大腸菌では難しいかもしれません。例えば、分子内にジスルフィド結合がある場合、大腸菌ではミスフォールディングをひきおこしている可能性もあります。 可溶性に発現することが目的なら、pColdベクターのTrigger-Factor-tagをおすすめします。ただ、無理やり可溶性に移行させているようで、tagが切れなかったり、切れたら沈殿したりといったこともあります。可溶性にとることだけが目的なら良いのですが、その後の実験手法によっては可溶性タグがかえって邪魔になることもあります。

(無題) 削除/引用 No.5455-14 - 2016/10/12 (水) 21:18:17 - AP 封入体から可溶化するのがいやなら、真核細胞での発現系や無細胞転写翻訳系にいったほうがいいかも。 こんなのとか https://www.funakoshi.co.jp/contents/4031

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