いつもお世話になっています。
現在、マウス神経前駆細胞の分化における遺伝子Xの役割を調べており、レンチウイルスを用いて3つのコンストラクトの発現を試みました。
1.EF1aプロモーター 2AペプチドGFP
2.EF1aプロモーター 遺伝子X 2AペプチドGFP
3.EF1aプロモーター Ascl1 2AペプチドGFP
Infectionと同時にGrowth factorを除き分化を誘導しました。その結果、Ascl1では形態的にもマーカでも40％の細胞で神経へ分化を確認できたのですが、1、2とも（のみ）にGFP発現細胞において細胞にぼこぼこ穴が開いたような像が観察されました（扁平な緑色に光る細胞の所々が黒いスポットとして抜けた像）。この細胞に神経マーカーは発現していません。CMVプロモータ下にGFPを繋ぎトランスフェクション試薬を用いた場合にもこのような現象が観察されました。
この原因を調べたいのですが、黒いスポットが現れる現象を何と呼ぶかわからないため検索できず困っています。ご存じないでしょうか？
また、神経前駆細胞に強制発現して、分化への影響を調べる場合の良いプロトコールをご存じないでしょうか？
たとえば、Infectionの後、一旦パッセージを行い改めて分化誘導を行う方法の方が細胞へのダメージは少なそうな気がするのですが、よくわかりません。
よろしくお願いします。 |
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