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(無題) 削除/引用 No.5446-5 - 2016/10/04 (火) 21:09:22 - weeei ほんとさん なるほど、手技の練習にもなりそうですね。 貴重なアドバイスをありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5446-4 - 2016/10/04 (火) 20:02:42 - ほんと 可溶性のものであればすぐに溶けると思いますよ。 可能であれば、その細胞ではなくまず手をつけやすい細胞をもらって、同じような操作でみたいタンパク質が抽出されるかをポジティブコントロールとして見た方がより安心かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.5446-3 - 2016/10/04 (火) 19:42:31 - weeei ほんとさん お返事ありがとうございます。 wellごとに氷上放置を挟むと、時間差が出てしまうと考えていたのですが、 Lysis添加後すぐ溶解するものですか？(初歩的な質問ですみません)

(無題) 削除/引用 No.5446-2 - 2016/10/04 (火) 19:35:24 - ほんと まず最初の1 wellに200 ul入れて、それをlysisしたら隣のwellに200 ulずつ入れて順にlysisすればいいのでは？ あるいは、100 ulで同じようなことをして、20 well分回収したら、新しい100 ulのlysis bufferを最初の1 wellに入れ、同じことを繰り返せば回収率があがるかもしれません。

48wellからの回収法 削除/引用 No.5446-1 - 2016/10/04 (火) 19:31:37 - weeeei 初めてWestern blotting法に手をつけます。 細胞回収から躓いているので、お力をお貸しください。 私が扱っている細胞はわけあって48well plateでしか培養できません。 48wellに培養した細胞を20well分を集めて、ウエスタン用にしたいと思っております。 細胞が全体に増えるタイプではないので、20well分でせいぜいLysis Bufferの量は200μLが限界だろうと教授はおっしゃっていました。 そこで、2つの手法を考えました。 �@PBS下でセルスクレーパーを用いて掻き集め、遠心分離で沈殿物をとり、Lysis Buffer200μLで溶解 �A10μL/wellでLysis Bufferを入れて氷上放置、その後集める �@は簡単ですが、PBSで洗うことに賛否両論あること、刺激が多いためサイトゾルにあるターゲットが漏れ出してしまいそうであると考えられます。 また、�Aは単純に10μL/wellではとても集められないそうにないと思い、決めきれず困っています。 �AのLysis Bufferのスケールアップ以外、方法はないでしょうか。 48wellから細胞を回収したことがある方、もしくは�@�Aへのご指摘や他にアイデアのある方、ご教授いただけないでしょうか。

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