AP様、早速コメントをいただきありがとうございます。
> pGEXを始め、発現用のプラスミドはコピー数が増える変異をもたないpBR oriであり、変異をもつハイコピーのpUCやpBSと比べると細胞あたりのコピー数が1/20くらいなので、そのせいでバンドが薄いというのは当然のことかと。
恥ずかしながら、これについては知りませんでした。
http://www.promega.co.jp/jp/jp_tech/FAQs/Q&A_WizPlasmid.htm
low copyよhigh copyの違いは複製起点に変異があるかないかで決まるんですね。
これを知らずに約10年ほどクローニングの操作をしてきました。
AP様からいただいたコメントをともにプロメガの内容を深く読み進めることにします。ありがとうございます。
ただ、今回、insert無しでligationして出てきたコロニー（originalのpGEX-4T2であろうと予想される）のバンドの出方が、オリジナルのものに比べて違っているんです。まるで形質転換、mini cultureあるいは、miniprepでプラスミドが組替えを起こしておかしなことになっているような気がしています・・。
今回、GEのマニュアルを読んで、pGEXにはlacI^qが乗っているので、大腸菌のホストを選ばないと書かれてありましたので、DH5alphaを使用しました。以下がその一文です。
《pGEX vectors carry the lacIq gene, so there are no specific host requirements for propagation of the plasmids or for expression of tagged proteins. As previously noted, an alternate strain (e.g, JM109, DH5α) is recommended for maintenance of the plasmid.》
ただ、Dh5alphaを使って、pGEX-4T1もpGEX-4T2もうまく行っていないので、大腸菌を変えるというのも試してみます。どちらの大腸菌も、Ampicillinを加えたLB plateに播種し、それを一晩培養して、Ampicillinを加えたLB液体培養にさらに持っていく（37度）ので問題ありませんよね。
insert無しでコロニーがすごく沢山増えていたので、クローニングは問題ないと思っていました。pUCやpBSのvectorがあるかはわかりませんが、まず探してみます。
いただいたコメントを拝見して、クローニングには自信があったので高を括っていましたが、思いの外、マニュアルには書かれていないことが大事なようで非常に困惑するとともに、情けなく感じています。
ただ、クローニングのことを置いておいても、originalのプラスミドをただ形質転換しただけでも目的のoriginalのプラスミドが得られていないことを考えると、大腸菌との相性（といってもpGEX-4T2などをDH5alphaに形質転換している方は山ほどおられるとは思いますが）が私の場合にはいけないかもしれないですね。ありがとうございます。まずは大腸菌を替えてみます。
またそれ以外にコメントいただけるようでしたら、どうかよろしくお願い致します。
恥ずかしながらクローニングで約ひと月も失敗が続いていますので、一つでもコメントをいただけるととても嬉しいです。どうぞよろしくお願い致します。 |
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