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(無題) 削除/引用 No.5425-5 - 2016/09/26 (月) 14:39:43 - asan 一般的には、リポフェクション系試薬での遺伝子導入は細胞増殖がないと発現効率が低下するとか言われてます。理由は色々あると思いますが、一つにプラスミドは核膜を通過できないので、大量に核内に入るために脱核のタイミングが必要だとか言う話もあります。 いずれにせよ、HEKやHELAくらいならある程度は大丈夫だとおもいますが、抗生物質フリー（毒性を減らす）でトランスフェクションするプロトコールは良くやりますが、無血清でやるプロとコールはあんまり一般的じゃないと思いますし、最近の有名な細胞ならそのまま24時間放置で問題ないことがおおいでしょう。 分泌タンパクを回収する目的でやるなら、アルブミンの問題があるので自分なら24時間普通にトランスフェクション後に出来るだけメディウム量を下げて24-48h無血清あるいは0.1%-1%で培養して上を回収するのが一番いいかなと思います。無血清だとダメでも、わずかにでも入ってると生きらレル細胞もいますし、これは血清中の未知の低分子かなんかが増殖に必要な細胞とかもあります。透析血清を使うと増えなくなるような細胞もあるので。

ありがとうございます。 削除/引用 No.5425-4 - 2016/09/23 (金) 21:38:45 - Bee お返事が遅れてしまって申し訳ありません。 詳細に書いていただき本当にありがとうございます。 参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.5425-3 - 2016/09/23 (金) 06:31:44 - PK HEK293Tに分泌タンパクをコードするプラスミドをPEIでトランスフェクション（オーバーナイト）した後、無血清培地（DMEMと抗生剤のみ）で７２−９６時間培養し、培地を回収して分泌されたタンパクをウエスタンで検出する、という流れの実験をルチーンでやってます。実験初心者のマスターの学生さんにも何人かやってもらいましたが、皆さんうまくいっています。無血清で９６時間培養すると、さすがに細胞の状態は悪いですが、分泌タンパク量をウエスタンで見る限り、２４時間培養よりも回収量は多くなります（少なくとも私があつかっているタンパクでは）。お使いの細胞によるとは思いますが、少なくとも293Tの場合は、無血清培地でも大丈夫と思います。

(無題) 削除/引用 No.5425-2 - 2016/09/23 (金) 01:55:29 - 信 Opti-MEM added with ITS is I used to use.

トランスフェクション後の培地交換に用いる培地について 削除/引用 No.5425-1 - 2016/09/23 (金) 00:04:02 - Bee プラスミドトランスフェクション後、4-6時間経って培地交換をするというプロトコルが一般的かと思います。 プラスミド導入によって高発現した蛋白質の培地への放出を確認するために、上記の培地交換の際に血清無培地を用いようと思うのですが、血清が無いことによる問題などあるでしょうか。ぜひご教授ください。または、どなたか既に行ったことのある方はいらっしゃいますか。

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