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(無題) 削除/引用 No.5412-2 - 2016/09/19 (月) 07:06:52 - mon いくつかの細胞(293,CHO,その他不死化細胞）で試していますが、どれでもDNA:PEI-MAXの重量比は1:3~5あたりが最適でした。DNA量は、lipofetionの2〜３倍が良いようです。 導入効率をGFP発現ベクターで調べると、293(T)細胞で目視で60%-80%位GFP陽性になります。 私は、1 or 10mg/mL PEI-MAX溶液を希釈したDNA溶液に直接添加して直ぐに混和しています（希釈したPEI-MAX溶液でも導入効率は変わらない）。 DNA/PEI液量は増殖培地の1/10~1/5にしています。 6well(35mm dish)の場合、2ug DNA/200uL OptiMEM+8ug PEI-MAX(8uL)を試してください。混和後15分（~1時間）置いてから細胞（培地1mL)に滴下・混合します。 なお、PEI-MAX溶液は HBSSに溶かして塩酸でpHを中性付近（pH試験紙でOK)に合わしてfilter滅菌。phenol redを添加して色を中性付近に合わせてもOK。 小分けして-80℃に保存しています。使用中のものは-20℃保存。 また、PEI-MAXの分子量に関して25kDaより2.5kDaの方が導入効率はやや良いです。

PEImax 293T transfection 削除/引用 No.5412-1 - 2016/09/18 (日) 10:23:08 - Sei 質問させてください。 293T細胞へのtransfectionを行っています。これまでFugene6を使用していましたが、コストが嵩むので、PEImaxに変更できればと思考錯誤しています。 ただ、Fugene6で導入した場合8-9割の導入効率が認められますが、PEImaxの場合、2割しか入りません。以下が私が行っているプロトコルですが、もし同じようなことをされてる方がみえましたら、誤っているところをご指摘頂けませんでしょうか？ 1.　24時間前に、293Tを6ウェルプレートに1x10E6まく。 2.　eppen tubeにOPTI-MEM1 150 ul にDNA　4 ugを加え、 もう一方のtubeにOPTI-MEM1 150 ulとPEImax 30 ul (30 ug) を加え、室温5分待つ。 3.　両者を混和し、室温で15分待つ。 4.　10% FBSを含むDMEM（抗生剤有り）1 mlをeppen tubeに足し、その中で試薬と混和 5.　すぐに6-ウェルから培地を除き、4で調製したtransfection試薬を直接ウェルに入れ、そのまま48時間培養を行う。 6.　フローサイトメトリーにてGFPの発現細胞を算出することでtransfection効率を算出する。 以上になります。周りでPEImaxを使用している方がおらず、Fugene6の方法に沿って行いました。DNA量は固定して、PEImaxの量を1.5倍、2倍にしても導入効率は増加せず、むしろ2倍増やすと細胞のバイアビリティは低くなりましたので、DNA　4 ugに対して、PEImax 30 ulが妥当だと思っています。 抗生剤を含有しているDMEMでも細胞は死んではいないようです。 また血清は10％含まれているのも懸念材料の一つです。 一つずつ他の培地に試したり、抗生剤を抜いたり、血清濃度を振ったりを今週していきますが、もしここでアドバイスを頂けるととても参考になります。どうぞ宜しくお願いたします。

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