全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.5403-7 - 2016/09/19 (月) 22:20:15 - ドンタコス PK様 FACS用の抗体は特異性が低いのですね。 貴重なご意見有難うございます！ 先に固定してからPermeabilizeでやってみます。 有難うございます！

(無題) 削除/引用 No.5403-6 - 2016/09/17 (土) 08:59:59 - PK 以前、FACS用の抗体でウエスタンをやってみた事があります（FACSの抗体は概してウエスタン用の抗体より安価なので）。細胞表面のFACSでは特異性がかなり高いと考えられる結果が再現性をもって得られていたのですが、ウエスタンではバンドがたくさん出てしまい、使えない事が分かりました。表面マーカーFACS用の抗体は、細胞表面に露出しているタンパクの中では、その標的タンパクに特異的に結合するものの、細胞内のタンパクまで広げてしまうと、交差反応するタンパクが他にも色々あるのではないかと、考えています。また、造血系の表面マーカーの場合、細胞表面には出てない細胞でも、細胞内では発現している場合があります。よって、emaさんがおっしゃるように、表面マーカー染色を先にして、固定してからpermeabilizeするのが良いと思います。

ICS flowcytometryに関して 削除/引用 No.5403-5 - 2016/09/14 (水) 09:55:43 - ドンタコス ema様、 的確なご助言ありがとうございます。 なるほど、その方法であれば非特異的な反応が抑えられますね。 試してみます！

抗体を付ける順番 削除/引用 No.5403-4 - 2016/09/14 (水) 09:30:01 - ema Permeabilizeは細胞内に入らないものを入れるために膜に”穴”あけている状態です。もう生きてないので穴が開閉して必要なものだけを通すことはありません。細胞（袋）に小さな穴がたくさん、というイメージをすると、通過する大きさのどんな物体でも一回入って、袋の中に入ったものが残りやすいですよね。 ＞T細胞マーカーanti-CD4やB細胞マーカーanti-CD138を用いても細胞内に結合 私は表面抗原・膜抗体等は、Permeabilize前に染めてから、Permeabilizeして細胞内サイトカイン等の抗体染色というようにしていました。 実験ステップが多くなるし、時間がかかりますが、変な結果をだすよりか分けてみてください。

ICS flowcytometryに関して 削除/引用 No.5403-3 - 2016/09/14 (水) 08:49:56 - ドンタコス おkc様 早速のご回答有り難うございます。 1mlのPFAで固定後、10mlのBlocking bufferで1回 washし、Permeabilizeを行い、その後、同様にBlocking bufferで2回 washし、再度Blocking bufferを入れ30分間氷上においております。 その後抗体を1:300で加えています。 （少し抗体が多すぎかもしれません）。 アルデヒドが架橋している可能性も大ですね。 washを増やしてみます。

(無題) 削除/引用 No.5403-2 - 2016/09/14 (水) 08:20:14 - おkc 固定後、過剰なアルデヒドはきちんと除けていますか？そうしないと抗体と細胞とが架橋されてしまうと思います。

ICS flowcytometryに関して 削除/引用 No.5403-1 - 2016/09/14 (水) 07:59:32 - ドンタコス いつもお世話になっております。 この度FlowcytometryのIntracellular stainingに関して質問させて頂きます。 現在白血球の細胞内タンパク質の発現を見るために、細胞をPFAで固定、Permeabilize (TweenあるいはTriton X)した後に、蛍光付きの抗体で染色し、フローサイトメトリーで発現確認をしております。 色々と実験を行っているうちに感じたことは、細胞を固定、Permeabilizeすると、どんな抗体でも細胞にくっついてしまうということです。 例えばコントロール実験として、NIH3T3やCos-7細胞に、T細胞マーカーanti-CD4やB細胞マーカーanti-CD138を用いても細胞内に結合してしまいます。Permeabilize前は結合しません。 Permeabilizeして細胞内部を露出すると、何でもかんでも抗体はくっついてしまうものなのでしょうか？ Blocking は2％BSA in PBSで30分間行っております。 どなたかお詳しい方がおりましたらご教授頂けると幸いです。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---