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(無題) 削除/引用 No.5389-6 - 2016/09/05 (月) 20:24:51 - プロモ みなさまコメントありがとうございます。 >[Re:4] monさんは書きました : > > 精製したb-Gal発現アデノウイルスなら、HeLaでは100%の感染効率でも死にません。 > 粗精製ウィルス液でもHela培養液の1/100vol以下で100%の感染効率になります。 やはりHeLaでは感染100％が可能なのですね。そうするとプロモーター干渉とはべつにアデノウイルスの作成に問題ありそうですね。 それはそれでどうにか見直してみます。 おおさんやKarasさんのコメントからして、プロモーター干渉が全く起きないようなプロモーターの組み合わせを試しても、必ずしもうまくいくという結果にはならなそうですね。 感染効率を調節するのであれば、今すぐにでも実行できるので、まずは感染効率を調節して、両者が実験に使えるレベルの発現ができるような条件をさがしてみようと重い案巣。

(無題) 削除/引用 No.5389-5 - 2016/09/05 (月) 15:47:53 - Karas プロモーター競合と思わしき現象を経験したことがあります。 私の場合には2回ともレンチウイルスを用いての実験です。まずレンチウイルスでGFPを細胞に発現させ、2日後にGFPを発現した細胞でだけmCherryを発現するレンチウイルスを培養細胞に加えました。両方ともCMVプロモーターです。 肉眼で観察すると、GFPを発現した細胞でだけmCherryが発現しているのは確かでしたが、GFPが弱く見える細胞ではmCherryが強く、GFPが強い細胞ではmCherryが弱いような感想を覚えたことがあります。何も発現していない細胞に2回目のレンチウイルスを掛けてmCherryの蛍光がないことは確認しています。 その結果を見てプロモーターの競合を疑いましたが、プロモーターの変更ではなく、「おお」さんのおっしゃる通りレンチウイルスのMOIを調節することで、GFPとmCherryの両方を発現している細胞を多く取得できる条件を見つけることで解決しました。 もしくは別な実験の為に共発現している細胞が必要ということでしたら、フローサイトメーターや古典的な単一細胞クローニングで、少なからず存在している共発現細胞を取得されては如何でしょう。 プロモーターの変更が悪いわけではありませんが、各種プロモーターが競合するかしないかに定説は無く、色々試した結果徒労に終わる可能性があります。 投稿内容を拝見すると手技も含め複合的な問題のようにも見受けられますので、それを一つ一つ解決したのちに手を付けてみると良いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5389-4 - 2016/09/05 (月) 12:07:44 - mon >[Re:1] プロモさんは書きました : > ちなみにアデノウイルスをHeLaに感染させると、死細胞が多かったり感染効率がよくなく 精製したb-Gal発現アデノウイルスなら、HeLaでは100%の感染効率でも死にません。 粗精製ウィルス液でもHela培養液の1/100vol以下で100%の感染効率になります。 Helaで死細胞がみられる場合、RCAの混入や、粗精製ウイルスの液中遊離ウィルスタンパクが悪さする場合(MOI>100だと顕著）があります。もちろん過剰発現したタンパクの影響も考えられます。この場合、293細胞でのウィルス産生効率が低い（収率が低い）ことが多いです。 > アデノウイルスはほとんどの細胞株で100%の発現ができるものでしょうか？ そんなことはありません。PEIやPLLと併用してウイルスのEndocytosis（？）を誘導すると導入効率は上昇します（それでも100％にはならない細胞もありました）。

(無題) 削除/引用 No.5389-3 - 2016/09/05 (月) 04:49:47 - おお ちょっとまってください。感染効率が２０％なら理論的には８０％の細胞では競合などはおこらないですよね。 なので、感染により細胞の生理状態が変わった（悪くなった）のかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5389-2 - 2016/09/05 (月) 04:33:13 - おお いろいろな可能性が考えられるので潰せるものは潰していくか、妥協点を探るかでしょうね。 妥協点の方はアデノの感染量を下げていって両者の発現のバランスで納得行く点があるか見てみるといいかと思います。 プロモーターの競合かどうかはレンチであなたの興味ある遺伝子でなくGFPなどを発現したものがあればわかるでしょう。 もし競合でなければ、、、まあここまで書けばわかると思いますのでそういう場合はどうするか考えてみてください。

プロモーターの競合について 削除/引用 No.5389-1 - 2016/09/04 (日) 18:10:48 - プロモ 哺乳類培養細胞にウイルスを使って２つの遺伝子発現をしております。 片方はレンチウイルスでCMVプロモーターを使って（LentiPとする）安定発現株として発現させており、あとからアデノウイルスでCAGプロモーターを使って別の遺伝子（AdenoPとする）を発現させました。しかしアデノウイルス由来の遺伝子AdenoPが過剰発現になった細胞ではレンチウイルス由来のLentiPの発現が弱くなり、2つを発現している細胞がほとんどありません。もしCAGプロモーターはCMVを含んでいるため、EF1とかの他のプロモーターにすれば解決するものでしょうか？もしくは遺伝子の過剰発現自体が競合してしまうのでしょうか？ご経験あるかた、教えてください。 ちなみにアデノウイルスをHeLaに感染させると、死細胞が多かったり感染効率がよくなく、A549でも２０％ほどの感染しかみられません。これは私のアデノウイルスの作り方に問題があり、アデノウイルスはほとんどの細胞株で100%の発現ができるものでしょうか？

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