Bio Technical フォーラム

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CreERT2 トピック削除
No.5379-TOPIC - 2016/09/01 (木) 17:51:29 - James
お世話になっています。

CreERT2のConditional knockout mouseを使った実験系の構築を行っています。
CreERT2を発現した細胞特異的に遺伝子を強制発現させるため、目的遺伝子を逆向きのloxPで挟んだレンチウイルスベクターを作製しました。
ここで質問ですが、その際にタモキシフェンの投与は必要でしょうか？

タモキシフェンはCreERT2を核移行させることでゲノムの組換えを起こしますが、ウイルス由来の逆転写されたDNAは細胞質にもあるため投与が必要になるのか気になって質問させていただきました。

似た実験を経験した方がおられましたら、是非ご回答宜しくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.5379-6 - 2016/09/21 (水) 16:05:37 - James
しばらくチェックできておらず、返答が遅れて申し訳ありません。

目的はknockoutではなく、強制発現系です。conditional knockoutと書いてしまったため、混同させてしまいました。申し訳ありません。実験系が損傷モデルであるために、多少なりともダメージのあるタモキシフェンは可能であれば使いたくなかったので、このような質問をさせていただきました。

実際に試してみたところ、タモキシフェンなしでもtransductionした遺伝子の発現が観察されました。タモキシフェンで組換が増強される可能性もありますが、かなりくっきり見えていたのでこのまま実験を進めたいと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.5379-5 - 2016/09/10 (土) 09:17:04 - PK
反転した状態で挿入された目的遺伝子を、互いに向きが逆のLoxPで挟んだレンチウイルスベクターを作って、標的細胞に感染した後、CreERT2で再度反転する事により発現誘導するのが目的と理解して良いでしょうか？　ノックアウト目的ではないですよね？

その上で、4OHTが必要かどうかですが、ベクター由来のプロウイルスが細胞質に存在するという仮定で考えた場合でも、4OHTは必要かもしれません。CreERT2はHSPなどのシャペロンと複合体を形成して細胞質に存在しており、この状態では核移行のみならずCreの活性そのものが抑制されているかもしれないので。

実際にはプロウイルスは標的細胞のゲノムにインテグレートしているので、目的遺伝子の誘導には4OHTが必要です。ただし、CreERT2は結構leakyで、一部の細胞では4OHTなしでもシャペロンから外れて核移行し、目的遺伝子を発現するかもしれません。4OHT有無での目的遺伝子の発現を、CreERT2を発現していない細胞と比較してみて、実験目的に合う方を選択すれば良いと思います。

(無題) 削除/引用
No.5379-4 - 2016/09/08 (木) 12:27:45 - Bond
趣旨が理解出来ないのですが、まず、遺伝子をknockoutしたいのか強制発現させたいのか。
CreERT2発現mouseとConditional knockout mouseは指すものが違います。
そして何より、タモキシフェン投与が必要であることは目的から考えてプラスなのかマイナスなのか。
「投与しなくてもCreが働いてくれるなら楽で良い」のか「投与していないのにCreが働いてしまっては困る」のか。
前者なら実際に試してみて「やっぱりタモキシフェン投与が必要でした、残念」で済むけれども、後者では系全体を作り直す必要すらあるでしょう。
ちなみに、この手の実験でより一般的なのはRosa26に同コンストラクトをknockinすることだと思います。

(無題) 削除/引用
No.5379-2 - 2016/09/01 (木) 21:32:20 - おお
ウイルスゲノム細胞質にあるけど、DNAはないんじゃないかな。。。一度ウイルスについて基礎的なところをおさらいしたらどうでしょう。

CreERT2 削除/引用
No.5379-1 - 2016/09/01 (木) 17:51:29 - James
お世話になっています。

CreERT2のConditional knockout mouseを使った実験系の構築を行っています。
CreERT2を発現した細胞特異的に遺伝子を強制発現させるため、目的遺伝子を逆向きのloxPで挟んだレンチウイルスベクターを作製しました。
ここで質問ですが、その際にタモキシフェンの投与は必要でしょうか？

タモキシフェンはCreERT2を核移行させることでゲノムの組換えを起こしますが、ウイルス由来の逆転写されたDNAは細胞質にもあるため投与が必要になるのか気になって質問させていただきました。

似た実験を経験した方がおられましたら、是非ご回答宜しくお願い致します。
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