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(無題) 削除/引用 No.5362-8 - 2016/09/02 (金) 14:41:41 - 7744 そこまで少ないなら、精製せずにRTしてqPCRでもいいかもしれません。 トライトンでライシスして、そのライセートに直接RTマスターミックスを入れてRTする方法もありますよ。 イスラエルの研究チームがその方法でRNA-seqをしていた気がします。 それならロスすることもないし、もっと少ない細胞でもできるので希望に叶うのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5362-7 - 2016/08/31 (水) 12:45:12 - AP "RNA carrier"でぐぐってみると、微量RNAの精製法に少なからず出てきますし、市販の微量サンプル用キットでも主要なトリックとなっているようです。 最近じゃpoly Aホモポリマーを使うのがトレンドのようです。 微量サンプル、シングルセルのqPCRやRNA-seqなどにも使われているようですが。

(無題) 削除/引用 No.5362-6 - 2016/08/31 (水) 04:08:28 - ANO アルコール沈殿で使うチューブは丸底より平底が好きです

(無題) 削除/引用 No.5362-5 - 2016/08/29 (月) 03:49:59 - 微量 ANOさん、 アドバイスありがとうございます。RNAisoはTrizol系の試薬ですね。確かにカラムを介さない方がロスをコントロールしやすいかもと思っていました。 時に、低吸着のチューブはすべてのステップで使っておられるのでしょうか。 どうもこの手のチューブだとエタ沈のペレットが滑りやすい気がするのですが、、、

(無題) 削除/引用 No.5362-4 - 2016/08/27 (土) 20:42:01 - ANO カラムが嫌いなので、Trizol相当のタカラバイオ製品RNAiso plusを使っています。 イソプロ沈殿の際に、日本ジーンの”エタ沈メイト”を使うと、RNAが沢山とれます。 http://nippongene.com/siyaku/product/extraction/ethachinmate/ethachinmate.html それから、RNAの吸着ロスが少ないマイクロチューブやチップを使うことも必須です。当方ではイナオプティカを使ってます。

(無題) 削除/引用 No.5362-3 - 2016/08/27 (土) 19:34:34 - 微量 APさん、 アドバイスありがとうございました。キャリアーを入れるのはたしかに有効そうですね。 RNA-seqを行うときは難しいかもしれないですがqPCRの実験の際に試してみます。

(無題) 削除/引用 No.5362-2 - 2016/08/27 (土) 10:59:11 - AP そういう目的用にキットが出ていたりするので、なにか工夫があるのでしょう。 一般論的には、微量の核酸は吸着ロスやフェノール抽出での分配によるロスで致命的に失われてしまうので、キャリアー核酸を加えて核酸の総量を多くして行うというのが常套手段です。最近ではこういうことやるのかどうかわかりませんが、昔は最初にyeast tRNAやpoly(I,C)コポリマーなんかをマイクログラムオーダー加えてから抽出するなんて方法も行われていました。

少ない細胞からロスが少なくRNAを抽出するキット 削除/引用 No.5362-1 - 2016/08/27 (土) 06:24:21 - 微量 お世話になっています。 ある幹細胞の遺伝子発現解析のため少数の細胞からRNAを抽出してqPCRやRNA-seqを計画しています。教えていただきたいのは、少ない細胞から効率よくRNAを抽出する手法やキットに関してです。 予備実験として10,000から100細胞までを振ってカラムRNA抽出キット(Zymo RNA micro)を使ってRNAを単離し、RT-qPCRで得られたRNAの量を評価しました。 また、この細胞数に相当するように既知量のRNAをDiluteしてスタンダードとしました。 驚いたことに細胞数が少なくなるにつれて、得られるRNAが理論値よりもかなり少なくなっており、100細胞を用いた際には想定の1/10程度しかRNAが無いことを示唆するデータが得られました（Ctで３以上離れていました）。 よってカラムベースの手法では持ち込む細胞が減るとロスが減るのではと考えております。 カラムを使わないTrizolによる抽出などを検討する予定ですが、もし勧めのキットなどがあれば 教えていただけると嬉しいです。 よろしくお願いいたします。

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