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シングルセルにすると死んでしまう細胞の継代 トピック削除
No.5358-TOPIC - 2016/08/26 (金) 07:17:28 - STK
マウス肺腫瘍（上皮系）の初代培養からの細胞株樹立を試みております。現在培養中の細胞が不死化しつつあるのですが、コンフルエントになったところでトリプシン-EDTAで継代すると、シングルセルになった細胞の大多数が浮遊したまま死んでしまいます。たまたまクランプになっていた細胞が選択的に培養プレートに接着して生き残り、その後増殖して再度コンフルエントになる、という状況を繰り返しています。この状況を改善するため、シングルセルにせず、上皮系細胞間の接着をある程度維持した細胞塊の形で継代しようかと考えています。何らかの前処理により、細胞間接着は維持したまま、培養プレートとの接着を弱め、その後スクレイプして小さめの細胞塊にして継代しようと思うのですが、この目的に合う前処理の方法について、ご意見伺えませんでしょうか？　
　
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No.5358-5 - 2016/08/27 (土) 03:08:51 - STK
TSさん、どうもありがとうございます。古典的な前処理の中で、どうするのが良いか聞いてみたいと思ったのが、このトピックを立てたきっかけだったのですが、RepCellのような製品が出ている事を教えて頂ける事も、本当にありがたいと思っています。

で、比較的安価で古典的な方法の中では、まずEDTA単独での処理を考えましたが、この場合、細胞ー細胞間の接着と、細胞ー細胞外基質の接着の、どちらに優位に効くのか（できれば、後者を優位に阻害したいです）よく考える必要がありそうです。トリプシンーEDTAで処理中の細胞を顕微鏡でみると、この細胞の場合、まず細胞間接着がとれて、シングルセル様の状態でプレートに張り付いた状態から、最終的にはがれてきます。最初の細胞間接着をとる過程で効いているのが、トリプシンなのか、EDTAなのか、両者の協調によるのか、実験してみないと分からない面もあるので、EDTA単独とトリプシン単独の処理を次の継代でためしてみようと思っているところですが、これではがれた細胞をRepCellに撒いたらどうなるか、見てみたい気もします。

TrpLE Expressは基本的にトリプシン-EDTAと同じ作用機序のようなのですが、どうでしょうか？また、ほかの酵素や細胞剥離用の製品で、細胞ー細胞外基質の接着に優位に効くものがあれば、試してみたいと思うのですが、、、

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No.5358-4 - 2016/08/26 (金) 15:25:39 - TS
たしかにRepCellもEZ Passaging toolも素晴らしいテクノロジーと思います。

ただ金額的に気になるのであれば、もう少しマイルドな剥離方法をトライするのありかなぁとも思いました。お金もあまりかからないし。

Trypsinや酵素を含まない細胞剥離溶液、PBS-EDTA、Tryple expressなどは試されましたか。

継代できない要因がトリプシンや過消化なら可能性はあると思いました。

(無題) 削除/引用
No.5358-3 - 2016/08/26 (金) 09:12:33 - STK
outさん、どうもありがとうございます。RepCellもEZ Passaging toolも全く知らなかったので、本当に勉強になります。ウェブでみる限り、RepCellが良い（すごい技術だと思いました）と思うのですが、安い５枚組で何とかなるか、考えてみます。カタログを見ると可逆性とあるのですが、例えば、６ウェルプレートで、１ウェルだけ使って培養し、室温に戻して細胞をはがした後、同じプレートのほかのウェルに撒き直す（あるいは一回使ったウェルに、希釈した細胞塊をもう一回撒く）のは可能かどうか、分かりますでしょうか？

EZ Passaging toolはヒトES細胞用の製品みたいなのですが、ヒトES細胞の場合は、これを縦横にロールするだけで、コロニーが分割されて浮いてくるのでしょうか？　それとも、コラゲナーゼなどの酵素処理後に、使うのでしょうか？　もしよろしければ、教えて頂けると助かります。コスト的にはRepCellより良い気がする（オートクレーブできれば）ので、選択肢の一つと思います。

(無題) 削除/引用
No.5358-2 - 2016/08/26 (金) 07:56:40 - out
RepCellを利用するのはどうですか？
あるいは、ThermoのEZ Passaging Toolを使ってスクレーパーで剥がすとか。

シングルセルにすると死んでしまう細胞の継代 削除/引用
No.5358-1 - 2016/08/26 (金) 07:17:28 - STK
マウス肺腫瘍（上皮系）の初代培養からの細胞株樹立を試みております。現在培養中の細胞が不死化しつつあるのですが、コンフルエントになったところでトリプシン-EDTAで継代すると、シングルセルになった細胞の大多数が浮遊したまま死んでしまいます。たまたまクランプになっていた細胞が選択的に培養プレートに接着して生き残り、その後増殖して再度コンフルエントになる、という状況を繰り返しています。この状況を改善するため、シングルセルにせず、上皮系細胞間の接着をある程度維持した細胞塊の形で継代しようかと考えています。何らかの前処理により、細胞間接着は維持したまま、培養プレートとの接着を弱め、その後スクレイプして小さめの細胞塊にして継代しようと思うのですが、この目的に合う前処理の方法について、ご意見伺えませんでしょうか？　
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