Gelatin Zymographyを最近始めたばかりのものです。
サンプルは培養細胞をOPTI-MEM1のみで培養して3日目の培養上清です。
プロトコルはAbcamが公開しているGelatin Zymography protocolに従っています。
まず、20x10E4 cells per a well of 24-wel plateで細胞を播種し、250 ulのvolumeで3日間培養しています。その上清をアミコンの限外濾過スピンカラムにて10倍に濃縮し、まずは20, 10, 5, 2.5 1.25 ulと量を変えて0.1% Gelatin-containing 7.5% SDS-PAGEにアプライしました。
このpreliminary studyの目的はGelatin Zymographyがそもそもうまくいくかどうか、おおよそ何ulをwellにアプライすべきかを検討するためでした。
結果、1.25 ulでも綺麗に62 kDaの部分がCBBで染まらず、おそらくMMP2の活性をみているのだと思います。一方、apply量が高くなるにつれ、62kDaのbandがブロードに大きくなり、多すぎであることが伺われます。
ここで質問なのですが、CBBで染めたのちに脱色をすると、S/N比が大きくなく、scannerでゲルを取り込むと1.25 ulアプライしたレーンでさえ、バックと変わらなく思えるんです。
そこで次のことを考えていますが、どの方法が良いでしょうか？経験者の方がいらっしゃればご教示いただけると幸いに存じます。
1. 脱色されすぎているということで短時間でゲル撮影をする
2. バックが脱色されすぎてもいいように、gelに含ませるGelatin濃度を0.1%から上げてみる。
3. CBB染色液の濃度を上げてみる（？）
4. 脱色液を薄めて使用してみる
5. etc...?
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