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(無題) 削除/引用 No.5341-27 - 2016/08/27 (土) 13:49:48 - おお 培養細胞ではほぼ一緒くらいの収量かなという感覚があります。

(無題) 削除/引用 No.5341-26 - 2016/08/27 (土) 10:47:33 - AP >>[Re:6] APさんは書きました : >> 細胞あたりの核酸量はRNAのほうがDNAより重量ベースで一桁は多いです。 >これって本当？ 私が普段使っている動物組織の感覚でとっさにそう言ってしまいましたが、一般化できることではなかったですね。組織種、細胞種によって違うし、特に培養細胞だとそれほどRNAは豊富ではないですね。多倍体性のも多くて、相対的にDNA量が多くなっているのもあるだろうし。RNA量はDNA量の数倍程度といっておけば間違いないでしょうか。Molecular CloningでHelaを例にした収量の目安が出ているのを見てみたら、下手したらほぼ同等というくらいにも読めました。

(無題) 削除/引用 No.5341-25 - 2016/08/25 (木) 01:46:49 - TK-1 >[Re:24] ふみさんは書きました : > 10倍とは言わずとも5-10倍ぐらいというところではないでしょうか。 > 経験的にはそうですし、Macherey-NagelのNuceloespinの説明書でも大体そんな感じのデータが載っています。 実際の感覚としては、1x10^6 cellあたり、DNAはだいたい10ugとれるけど、total RNAが50-100ugも取れたことなんてないと思うけど。。

当たらずとも遠からず 削除/引用 No.5341-24 - 2016/08/24 (水) 20:06:53 - ふみ 10倍とは言わずとも5-10倍ぐらいというところではないでしょうか。 経験的にはそうですし、Macherey-NagelのNuceloespinの説明書でも大体そんな感じのデータが載っています。

(無題) 削除/引用 No.5341-23 - 2016/08/24 (水) 19:04:58 - TK-1 >[Re:6] APさんは書きました : > 細胞あたりの核酸量はRNAのほうがDNAより重量ベースで一桁は多いです。 これって本当？

(無題) 削除/引用 No.5341-22 - 2016/08/22 (月) 19:39:07 - ぱそ APさま　おおさま 沢山のアドバイスをありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5341-21 - 2016/08/22 (月) 01:15:58 - おお 最近のナノドロップは蛍光の検出もできるようになってなかったっけかな。実際にアガロースなどで流した方がいいですけど、すぐに確認できる方法ではあります。

(無題) 削除/引用 No.5341-20 - 2016/08/21 (日) 16:38:16 - AP いや、バイオアナライザで見ろというのではなく、泳動の重要性を言ったまで。 通常はアガロースゲル電気泳動で十分。バイオアナライザではオーバースペックの上コストが高い。なによりゲノムDNAに適したチップはないんじゃないかな。 どういうバックグラウンドのラボにいるのかは知りませんが、DNAを扱うのであればアガロースゲル電気泳動はルーチンだと思うけどな。

APさま 削除/引用 No.5341-19 - 2016/08/21 (日) 15:49:58 - ぱそ 丁寧に教えて頂いて、ありがとうございます。 ちょっと感動しました。 電気泳動って大事なんですね。 核酸の泳動はやってないみたいなので、先生のお許しを貰って バイオアナライザにかけてみたいと思います。 その結果を私が読めるのか疑問ですが。。

おおさま 削除/引用 No.5341-18 - 2016/08/21 (日) 15:34:31 - ぱそ 添付して頂いたPDF、拝見しました。 Aの波形と全く同じだったような気がします。 英語苦手なので、時間をかけて解読したいと思います。 ありがとうございました。 核酸抽出後は、Nano dropで濃度を測って終了（sampleを凍結）で、 今回のように変な値が出ても、また取り直すだけなので、 異常値についての精査はしないみたいです。 皆様のおっしゃるように、電気泳動などで確認するのが基本？ということを、 初めて知りました。 電気泳動はwesternしかやってないです。

(無題) 削除/引用 No.5341-17 - 2016/08/20 (土) 18:11:18 - AP 吸光度の測定は撹乱要因が数多くあるので、nanodropのアウトプットだけしか見ないというのは非常に危険だと思うの。OD260が高い値だったとしてもDNAはあんまりなくて撹乱因子で下駄を履いているだけかもしれないでしょう。じつはRNAがよく除けていなくて定量値はほとんどRNAで占められているということもよくある（ただし260/280 ratioはDNAもRNAもそんなに大きく違わないので、それによってratioに異常値がでるということはない）。 たとえば外注でRNAseqとかmicro arrayをやってもらうとnonodropによる吸光度測定だけじゃなくバイオアナライザーによる泳動での評価も必ずするよね。 EtBrなどによる染色は核酸に選択性が高く撹乱要因が殆ど無いので実は非常に定量性が高い。正確に測定するにはそれなりの測定装置がいるけれど、肉眼による比色でも一桁どころか、2倍も狂わないんじゃないかな。吸光度の測定値が妥当かどうかは泳動してみればわかる（というか吸光度が異常であることが泳動して初めてわかったりする）。

(無題) 削除/引用 No.5341-16 - 2016/08/20 (土) 16:55:30 - おお その状態で吸光度はあてにならないから、濃度が測れてないと見るほうが妥当だと思います。もしかしてDNAが全くなくって、何か短波長側のピークのすそに２６０nmが来ていて２８０nmでは吸収がほとんどない状態なのでは？ guanidinium thiocyanateやGuanidineが入っていてDNAがほとんどなければそういう結果になりそうですし。 まずはDNAがあるのか、だいたいその濃度くらいといえるのか電気泳動などで確かめるのはやっておくべきなのでは？ でエタ沈はやらないのですか？ http://www.nanodrop.com/Library/T042-NanoDrop-Spectrophotometers-Nucleic-Acid-Purity-Ratios.pdf

APさま 削除/引用 No.5341-15 - 2016/08/20 (土) 16:35:48 - ぱそ 度々ありがとうございます。 そういうものなんですね。 先生に報告したときは、何でだろうね、また細胞を育てて抽出して・・ということだったので、原因が知りたくて投稿させていただきました。 勉強します。

Jさま 削除/引用 No.5341-14 - 2016/08/20 (土) 16:27:48 - ぱそ ご指摘ありがとうございます。 あまり深く考えずに言葉を使ってました。 私が言いたかったのは濃度の方です。 言葉はきちんと使わないといけませんね。 気を付けます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5341-13 - 2016/08/19 (金) 21:12:28 - AP >電気泳動はしていません。 >普通はやるものなのでしょうか・・・。 時と場合によるが、吸光度だけでは定性的な情報が得られない。電気泳動なら定性的な情報と半定量的な情報が同時に得られる。私はできる限りやる(非常に多くのサンプルをハイスループットでやるとかならいざ知らず)。 特にトラブルにであったらシューティングのためにやるというのは当たり前の発想ではないか?

(無題) 削除/引用 No.5341-12 - 2016/08/19 (金) 20:15:31 - J > RNAよりDNAの方が収量が低い理由が分かりました。 > 抽出したものが入る液の量（DNA-Elution Buffer：300µl,RNA-Nuclease-Free Water：50µl）が違っていたからのようです。 それ収量と濃度を取り違えてない？

おおさま 削除/引用 No.5341-11 - 2016/08/19 (金) 19:21:19 - ぱそ 回答ありがとうございます。 最初にNano dropで測定したときに、あまりの値にビックリしました。 ？？と思い、一回PCをシャットダウンしてから、 他の検体を測定しました。 それはいつも通りきちんと測定できたので、再び問題のDNAを測りなおしたところ、やはりダメでした。 今日、たまたまプロメガの人が来ていたので、 何か余計なものが混入する可能性を聞いてみました。 キットには、sampleを入れるLysis Bufferと吸着するマグネシウム？マグネット？とWash Bufferが入っているそうです。 それらが混入した場合、値はむしろ低くなるそうです。 高くなる原因は分からないと言っていました。

APさま 削除/引用 No.5341-10 - 2016/08/19 (金) 19:07:22 - ぱそ ありがとうございます。 RNAよりDNAの方が収量が低い理由が分かりました。 抽出したものが入る液の量（DNA-Elution Buffer：300µl,RNA-Nuclease-Free Water：50µl）が違っていたからのようです。 電気泳動はしていません。 普通はやるものなのでしょうか・・・。 友人が、RNAが大量に混入したせいでは・・と言うのですが、 そういう場合には値が大きくなるものなのでしょうか？ 無知ですみません。

(無題) 削除/引用 No.5341-9 - 2016/08/19 (金) 01:16:06 - AP 電気泳動はしましたか？ 既知量のスタンダード(最近のサイズマーカーは比色による量の推定ができるように各バンドのDNA量が明示されていたりする)と比較して見て、nanodropの定量値は妥当でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5341-8 - 2016/08/19 (金) 00:40:27 - おお くわえて、どのような方法論で抽出されているのか把握すると起こり得ることが想像できたりもしますのでなるべくならマニュアルなどよく読んで見ることをおすすめしますが、そうでなくともプロメガなどに一度問い合わせて見ると起こり得ることを把握していて教えてくれる可能性があるかもしれません。

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