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(無題) 削除/引用 No.5336-12 - 2016/08/29 (月) 14:03:36 - み westernではなく細胞染色でも発現が検出できないのですか？

(無題) 削除/引用 No.5336-11 - 2016/08/29 (月) 12:47:12 - おお 蛋白のレベルとして、非常によわくしか発現できない遺伝子もあります。なので（こう言うと申し訳ないかもしれないのですが）、蛋白が確認できないことがあってもあまり不思議には思いません。そういう場合は実験系の見直しも必要かもしれません。エンドでよく発現している細胞を選ぶと結果が違う可能性はあります。ほんとにTranslationを疑うならIn vitro translationで確認する手もありますが、、、そこまでする人はまれでしょう。 myc-Hisx5のタグですが、少し前からよくやられるようになったのは３x mycとかタンデムにタグをつなげたりするとかで、そうすると１オーダー以上検出感度が上がるとか言われているようです（比較実験はしてませんのでなんともいえませんけど）。いちどTagの部分がどうなっているか確認されるといいでしょう。WBの検出系も上げれないかちょっと考えてみてもいいかもしれません。 分泌蛋白なので、マイクロソームフラクションを集めてWBするてもあるかもしれませんが、どうでしょうか。 pCDNAはSV40oriもってますよね。

(無題) 削除/引用 No.5336-10 - 2016/08/29 (月) 12:07:42 - mon 無血清培地中だと不安定（or 壁面に吸着しやすい）かもしれないので、血清(1%程度）入り培地を試すとか。

(無題) 削除/引用 No.5336-9 - 2016/08/29 (月) 12:05:42 - mon >[Re:5] おおさんは書きました : > 大腸菌の分泌シグナルがついているとかじゃないですよね。詳しくは知らないのでなんとも言えませんが、そういうのってヒトの細胞で働くのかな。 経験上、大腸菌の分泌シグナルでも動物細胞で機能するものはあります（逆もあります）が、全てではありません（両者で機能するものは少ない印象があります）。また分泌シグナルの交換すると（分泌）効率が変わります。 話を戻して、293Tの一過性発現＋CMVプロモーターならウェスタンで確認できない程度に発現量が少ないことはないと思います。 培養上清・ライセートでもタンパクのバンドが確認できていないから、分泌障害＞ユビキチン化＝高分子化＝SDS-PAGEのゲルに入らない（ウェルに引っかかる）and/or プロテアソームでの急速分解なのかもしれません。ユビキチン化以降の現象は経験があります。この時はMG132（プロテアソーム阻害剤）を培地に添加して同じ実験を行ったところ、バンドが見えました。 もっとも、目的タンパクを回収するには、HSV-TK等の弱いプロモーターを使う and/or CHO細胞＠32℃培養(293細胞系では32℃で細胞死が起こるためお薦めしない）and/or stable trensformatを使う等でfoldingしやすいようにゆっくり発現させる必要があるかもしれません。。

(無題) 削除/引用 No.5336-8 - 2016/08/29 (月) 09:21:16 - pp CDSにStop codonが含まれているというオチはないとして。 分解されやすいタンパク質である可能性はありますか？ c-mycに対する抗体だけではなく、目的のタンパク質に対する抗体でも検出できませんか？ pcDNAは個人的には発現が低い印象を持っています。 コンストラクトに問題がなければ、他のプラスミドにうつしかえるかプロモーターを変えてみるのも一つの手だと思います。 また、分泌タンパク質ということなので、増殖因子系で293T細胞がレセプターを持っているなら、消費されてしまっている可能性も考えられます。 細胞種を変えて検討したことはありますか？

(無題) 削除/引用 No.5336-7 - 2016/08/29 (月) 05:51:30 - si 不思議ですね。すんなり発現しても良さそうなのですが。 私の経験では、Kozak配列をつけても多くても5倍も翻訳量が増えるかな？程度のイメージを持っています。 Kozak配列をつけないと翻訳されないなんてことは可能性としてはあるんだろうけどまぁ、そんなことはないよね。というイメージ。 元のプラスミドがおかしいか。 細胞を変えてみる。 とりあえずexpressされてるかRT-PCRで確認するとかしか無い気がします。

(無題) 削除/引用 No.5336-6 - 2016/08/28 (日) 15:19:01 - 小細工 おお様、AP様 コメントいただき、ありがとうございます。 kozakの必要性を感じ、constructionしなおし、293T細胞に強制発現させてみました。 具体的には、 kozak（GCCACC）配列-(ATGから始まるCDS)-(C末のmyc-Hisx5 tag)-STOPx2のconstructionです。 《もともと哺乳類のコーディング配列をベクターに入れて大腸菌で発現させたのを、また別のベクターに乗せ変えて哺乳類細胞にもどして発現させようとしているのでは？》 はい、その通りです。説明が不足してしまい申し訳ありません。 そうですね、コドンは293T細胞では問題ないはずです。 実験結果はまたしても発現が確認されませんでした。 transfectionのポジティブコントロールとして、pEGFP-N1を用いていますが、それではきちんとGFPが確認されますので、transfectionは問題なさそうですし、またmycタグのついた他のタンパク質を含むポジコンライセートでは抗myc抗体で染まるbandがガツンと見えますので、検出は問題なさそうです。 とすると私がコンストラクトしたプラスミドがワークしていないなどの理由でタンパク質が検出されないのだと思います。プラスミドのシークエンスは２度繰り返し、問題なく構築できていました。 westernに流したサンプルとしては以下の6つです。（mycのポジコン以外で） 1. pEGFP-N1導入細胞のライセート (50 ug per lane) 2. pEGFP-N1導入細胞から無血清培地中に分泌されたものを含む上清 50 ul 3. pEGFP-N1導入細胞から無血清培地中に分泌されたものを含む上清を10倍濃縮した50 ul 4. 目的のタンパク質導入細胞のライセート (50 ug per lane) 5. 目的のタンパク質導入細胞から無血清培地中に分泌されたものを含む上清 50 ul 6. 目的のタンパク質導入細胞から無血清培地中に分泌されたものを含む上清を10倍濃縮した50 ul プラスミドの構築はこれまでに約100ほど行ってきていますし、遺伝子導入、ウエスタンもルーチンに行ってきているので手技的な問題ではないと思いたいのですが、なぜkozak配列をもたせたとしても発現しないのかが謎です。 もしコメントをいただけるようであれば、心より感謝いたします。 どうぞ宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.5336-5 - 2016/08/17 (水) 16:52:32 - おお 大腸菌の分泌シグナルがついているとかじゃないですよね。詳しくは知らないのでなんとも言えませんが、そういうのってヒトの細胞で働くのかな。

(無題) 削除/引用 No.5336-4 - 2016/08/17 (水) 16:29:45 - AP >1. kozak配列を付け忘れていることに気づきました。kozak配列がないだけで全く発現しなくなるようなことはあり得ますでしょうか？ ありえます。 >2.元々大腸菌で発現させるためのプラスミドからpcDNA3,1+に載せ替えています。大腸菌と哺乳細胞は遺伝子情報が異なるでしょうか？ codon usageの差異はしばしば問題になりますが、 もともと哺乳類のコーディング配列をベクターに入れて大腸菌で発現させたのを、また別のベクターに乗せ変えて哺乳類細胞にもどして発現させようとしているのでは？　つまり大腸菌にいれたときは問題があるかもしれないけれど、哺乳類細胞に戻したんならむしろ好都合。それとも大腸菌で発現させるためにbacterializeしてあるのかしら。

(無題) 削除/引用 No.5336-2 - 2016/08/17 (水) 15:45:48 - おお kozakは疑うべき項目と思います。コドンはいいはずですけど。

kozak配列について 削除/引用 No.5336-1 - 2016/08/17 (水) 14:30:38 - 小細工 小細工といいます。Kozak配列についてお聞きしたいです。よろしくお願いします。 分泌タンパク質を293T細胞にて発現させたいです。 N末には分泌シグナル、C末にはmyc-Hisx5タグが付いています。共同研究先より大腸菌でタンパク質発現するプラスミドを譲渡いただき、それをpcDNA3.1+に載せ替えて、293Tに一過性発現させました。 コントロールとしてはpEGFP-N1を用いており、約100%が導入されています。 結論から言いますと、cell lysateにすらmyc抗体で染まるbandは見られませんでした。 培養上清でも見られませんでした。 シークエンスはしています。 ただ、気になる点が２つあります。 1. kozak配列を付け忘れていることに気づきました。kozak配列がないだけで全く発現しなくなるようなことはあり得ますでしょうか？ 2.元々大腸菌で発現させるためのプラスミドからpcDNA3,1+に載せ替えています。大腸菌と哺乳細胞は遺伝子情報が異なるでしょうか？例えばcodonなど。私が調べる限りでは大丈夫そうなのですが、double checkだけさせてていただけると幸いです。 よろしくお願いします。 小細工

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