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エクソソームとウイルスの厳密な分離方法は？ トピック削除
No.5328-TOPIC - 2016/08/13 (土) 11:11:31 - IF
ウイルス感染細胞が産生するエクソソームについて実験しています．
このエクソソームを精製分離し，TOF/MSで構成タンパクを解析する予定です．

この感染細胞は，ウイルス粒子も産生することが分かっていて，培養上清中からエクソソームのみを分離精製する際に，とても邪魔です．

市販のエクソソーム分離溶液で培養上清からエクソソームを精製し，ウエスタンブロットでエクソソームマーカーであるテトラスパニンを確認できました．ここまでは良かったのですが，ウイルスエンベロープタンパクも精製分画に確認されました．．．エンベロープタンパクに対する抗体で免疫沈降を試みましたが，そもそもエンベロープタンパクがエクソソームに含まれていることも想定する必要があると考えました．

エクソソームとウイルスの境界に悩んでいます．．．よい分離方法はないものでしょうか？どなたか同じような実験の経験はございませんか？また，よい知恵がありましたらご教示願います．
　
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No.5328-10 - 2016/08/20 (土) 00:54:13 - おお
一定の定義がないんですね。。。例えばウイルスが出芽する時たまたまゲノムが入り損ねた物があったとして、それはExosomeと言っていいのか、、、いろいろなやめるところですね。。。

(無題) 削除/引用
No.5328-9 - 2016/08/20 (土) 00:36:39 - 望月
ちょうど今週のPNASに解説記事がでてましたね。
http://www.pnas.org/content/113/33/9155.full

いまのところexosomeの定義は各々がするしかない（してよい）ようですね。

(無題) 削除/引用
No.5328-8 - 2016/08/16 (火) 09:30:27 - IF
おお様＞

その通りなのです．エクソソームにウイルスゲノムが入っている可能性があります．面白いですよね．ウイルスとエクソソームの境界をどう線引くのか？査読者がこんな質問してきたら困りますな涙

(無題) 削除/引用
No.5328-7 - 2016/08/15 (月) 21:37:02 - おお
まてよ、ウイルスゲノム由来のものであってもそれをExosomeが取り込んでる可能性があるか。

(無題) 削除/引用
No.5328-6 - 2016/08/15 (月) 15:11:13 - おお
ウイルスゲノム由来のものはのぞけるだろうけど、ウイルスの細胞の蛋白を抱え込んで出てくるので、共通したものをどの程度ウイルスだけに由来するものなのか、共通にあるものなのか、あるいはExosome特異的なものかという点で悩んでらっしゃるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.5328-5 - 2016/08/15 (月) 14:31:58 - asan

そもそも一般的にやられてるエキソソームMSの分離方法が何処まで厳密なものかは分からないので（ほとんどは超遠心かな？）、一定の濃縮がかかってるならよしとするのが現状だと思います。ウイルスが大半だとさすがに問題かもしれないが、MSでDIAをするならば同定されたウイルスタンパク質は無視すれば実験上はそんなに問題にはならないと思います。2つの条件で比較するにしても純度が同じ程度であればある程度は問題ないかなと思います。

(無題) 削除/引用
No.5328-4 - 2016/08/15 (月) 12:10:33 - IF
おお様＞

免疫沈降後に回収したエクソソーム分画について，ウイルスゲノムを確認してみます．ありがとうございます．

(無題) 削除/引用
No.5328-3 - 2016/08/13 (土) 16:11:00 - おお
あとウイルスの検出は蛋白でやるよりゲノムの核酸を見たほうが確実じゃないかな。。。

(無題) 削除/引用
No.5328-2 - 2016/08/13 (土) 16:09:07 - おお
ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2486346/
pharmpro.com/article/2014/03/high-performance-exosome-purification-and-characterization-density-gradient

ウイルスにもよるかもしれませんが、密度が若干違うかもしれませんね。

エクソソームとウイルスの厳密な分離方法は？ 削除/引用
No.5328-1 - 2016/08/13 (土) 11:11:31 - IF
ウイルス感染細胞が産生するエクソソームについて実験しています．
このエクソソームを精製分離し，TOF/MSで構成タンパクを解析する予定です．

この感染細胞は，ウイルス粒子も産生することが分かっていて，培養上清中からエクソソームのみを分離精製する際に，とても邪魔です．

市販のエクソソーム分離溶液で培養上清からエクソソームを精製し，ウエスタンブロットでエクソソームマーカーであるテトラスパニンを確認できました．ここまでは良かったのですが，ウイルスエンベロープタンパクも精製分画に確認されました．．．エンベロープタンパクに対する抗体で免疫沈降を試みましたが，そもそもエンベロープタンパクがエクソソームに含まれていることも想定する必要があると考えました．

エクソソームとウイルスの境界に悩んでいます．．．よい分離方法はないものでしょうか？どなたか同じような実験の経験はございませんか？また，よい知恵がありましたらご教示願います．
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