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(無題) 削除/引用 No.5308-7 - 2016/08/05 (金) 01:13:58 - asan ワークしてない抗体だ、というだけなら普通にflag tagでもつけた過剰発現細胞を取りあえずつくってそれでflagでみえるのにこっちの抗体では見えないけど、どうなってるんだ、って言えば十分じゃないかな、と思いますが。手持ちであるなら、リコンビナントとかを大腸菌でつくって流してもいいですが。 エンドレベルでの検出が見えないことが〜、という場合でもまずはエキソだと思います。エキソまで保証してるかどうかは抗体の種類にもよるでしょうし。免沈にかんしてもエキソ過剰発現でできるかどうかは見るべきでしょう。ちなみに、自分の経験上磁気ビーズは結合量が少なくなることがあるので、SepharoseとかAgaroseのピーズの方が沢山IPできると思う。まあ今回はそこまで関係ないでしょうが。 メーカーにもよりますが、ポリクロ抗体なんて中途半端なものも結構あるので、ダメならさっさと「上手く行くはずなのにおかしいぞ」というデータをもってメーカーに返金なり別の抗体に変えてもらうなりする方が早いですよ。

(無題) 削除/引用 No.5308-6 - 2016/08/04 (木) 19:55:42 - AP 何を言わんとしているのか、文章から読み取りにくいです。 何か考え方が、特殊なほう、ordinary でないほうに向かっている印象がある。 もう少し、スタンダード、オーソドックスな方法に学んだほうがいいんじゃないかな。 >WBがそんな面倒かな、、、IPしてWBしてるんじゃないの？ ですよね。 IPを泳動して通常の染色（なんでやってるんでしょうね、CBB? 銀染？）で見えるような実験はめったにない。普通はWBでしょう。どうしても染色というならせめて銀染はしてるんでしょうか？ 染色で見えるだけIPしようとしたら、量的にもかなり必要ですし、どれくらいのスケールが必要かもestimteできるでしょう？　今やっている系がそれに十分でしょうか（磁気ビーズって微量を迅速にやるには便利だけど、量を稼げるんですかね？　それには相当コストがかかりそう）？

(無題) 削除/引用 No.5308-5 - 2016/08/04 (木) 16:25:10 - おお >磁気ビーズに抗体が結合できていない これを疑うならまずこっちの確認のほうがかんたんだろうし、先にした方がいいんじゃないか？ WBがそんな面倒かな、、、IPしてWBしてるんじゃないの？ もしIPしてCBBとか銀染とかしてみているなら、磁気ビーズが抗体を回収しているとすれば、抗体のバンドが見れるはず（よほどインプットが少なくないなら）。 native-PAGEはいいんだけど、使う溶液中の抗原の量（WBでしか検出できないレベルでCBBとかで染色するとか）や検出方法を理論立てて組まないと誤った結論を導きそう。

(無題) 削除/引用 No.5308-4 - 2016/08/04 (木) 16:07:25 - TE > おおさん ご教授ありがとうございます。勉強になります。 WBはしていません。一つの方法として考えていますが、もっと簡単に確認できないかと考えています。Biacoreできればいいのですが、うちの研究室ではできません。 IPフラクションに抗原は確認できるのですが、もう一つ問題があり、磁気ビーズに抗体が結合できていないことも考えられます。 抗体と抗原の結合が確認でき、もし結合しているのでしたら、磁気ビーズと抗体の結合反応に問題があると考えています。 IPで抗原と抗体の反応条件と同じ条件で混合させて、native-PAGEしてみます。 お金も時間もかからないので試してみます。 もしもっと簡単な良い方法ありましたら、ご教授願います。

(無題) 削除/引用 No.5308-3 - 2016/08/04 (木) 15:53:15 - おお 同じ抗体でIPとWBをしているのですか？ その抗体はWBに使えますか？使えるなら親和性があるということになると思いますが、実験で使った溶液中で反応しないということになります。 ELISAは抗原抗体のアフィニティーをみる方法ですけど、あなたの使った溶液中の抗原の状態を考慮にいれるのか入れないのかで、実験の立て方や結果の解釈の違いが出てきます。 Biacoreみたいなものとか、蛍光色素をつけておいて、結合したときの複合体の質量が変わることによる蛍光の偏光の違いなどを見るのも評価方法になります。 native-PAGEによるバンドのシフトはできるような気がしますが、他の実験でもそうなのですが、使うサンプルによっては特異的な結合なのかなど評価が難しくなる可能性があります。 IPしているのだから、IPフラクションとIPして、ビーズを回収したあとの溶液の抗原の量がわかればラフに親和性はわかるんだけど、、、

(無題) 削除/引用 No.5308-2 - 2016/08/04 (木) 15:45:36 - たていす IPしても検出できなかったときの対応として、native-pageは方向が違うような気がしますが、、、 ＞1: 抗体と抗原の親和性の有無をnative-PAGEによるバンドの ＞シフトで確認することはできますか。 原理的にはできそうだけど、親和性の有無を簡単に確認する方法とは思えません。 ＞2: 抗体と抗原の親和性の有無を確認する簡単な方法はありませんか。 購入した抗体なのだから、メーカーの示している材料と方法で検出するのが簡単な方法です。 ＞免疫沈降を行ったのですが、SDS-PAGEにて目的のタンパク質のバンドを ＞確認できませんでした（すなわち、何もバンドが出てきませんでした）。 IPしたタンパク以外に、最低限、インプットの抽出液とビーズに結合しなかった素通りを一緒に分析するのが普通だろうと、勝手に思っています。しかし、「何もバンドが出てきません」ということなので、インプットやIPされなかった素通り見ていないかもしれませんね。

抗体と抗原の結合の確認を実験する方法 削除/引用 No.5308-1 - 2016/08/04 (木) 15:15:28 - TE 詳しい先輩方ご教授ください。当方、初心者です。 現在、あるタンパク質の免疫沈降を検討しています。 ポリクローナル抗体を購入し、磁気ビーズによる免疫沈降を行ったのですが、SDS-PAGEにて目的のタンパク質のバンドを確認できませんでした（すなわち、何もバンドが出てきませんでした）。 いろいろプロトコールの確認のうえ考察した結果、抗体と抗原の親和性に問題があるのではないかと考えております。 以下2点、質問です。 1: 抗体と抗原の親和性の有無をnative-PAGEによるバンドのシフトで確認することはできますか。 2: 抗体と抗原の親和性の有無を確認する簡単な方法はありませんか。 どうかよろしくお願い申し上げます。

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