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(無題) 削除/引用 No.5307-10 - 2016/08/05 (金) 09:38:49 - Loach Can get signalと同じ抗体反応促進剤のSignal enhancerを使っていた時の話ですが、一次抗体反応後TBS-Tで軽く洗ってTBS-Tで4℃保存していました。 土日挟むくらいは検出に問題を感じたことはありませんでした。ただ、一次抗体の性能によってはおおさんのおっしゃるように一次抗体をもう一度っていう方法が良いのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.5307-9 - 2016/08/05 (金) 00:11:08 - おお 場合によってはブロッキングが過剰になり感度が悪くなる可能性。 特に一般に売っているスキムミルクは糖分など栄養たっぷりで雑菌が繁殖することがある。４度ONぐらいだとまあ大丈夫ですが、ていうか雑菌が増えないようにONのときは４度にするのですがそれでも気になるのです。

(無題) 削除/引用 No.5307-8 - 2016/08/04 (木) 22:18:57 - AP ちなみに前記の方法は、DIGシステムでDIG-AP抗体を付けた後、検出まで一週間置いても大丈夫ですよとメーカーが言っていたもの(記憶が正しければ)。 質問の内容とちょっと違って、標識APがそれだけ安定ですよという話ですけど、抗体の結合もそれだけ安定だということですね。

(無題) 削除/引用 No.5307-7 - 2016/08/04 (木) 22:06:26 - AP バッファーでリンスしてメンブレンのヘリから余剰のバッファーを紙に吸わせてからサランラップで挟んで冷蔵庫で保存。 一次抗体入れっぱなしだとバックや非特異的反応が上がります。結合定数の低い反応でも時間が長ければそれなりに進みます。普段、一時間反応させる抗体を同じ濃度でオーバーナイトすると汚くなります。その場合は濃度を薄める。 ブロッキング液 に長くつけすぎると、オーバーブロッキングという現象がおこりその後の抗体反応が妨げられる危険性があります。

(無題) 削除/引用 No.5307-6 - 2016/08/04 (木) 21:40:36 - みんみ おおさん 横からすみません。 ブロッキング液に長時間入れたくない理由をお聞かせ願えますか？

(無題) 削除/引用 No.5307-5 - 2016/08/04 (木) 17:14:56 - 発注ミス >mon さん ＞抗体といえども結合・解離は平衡反応なので、抗体濃度が薄まると剥がれてきますので、一次抗体を入れっぱなしで置くのが良いと思います。 シグナルダウンしてしまうのは確かに怖いですがバックも怖いですね。 候補にしよう、とも思いましたが後述する　おおさんの方法がリーズナブルだと思いました。 ご回答ありがとうございます。 >abbさん 抗体自体の結合性は非常によく、IPで使えることが実証済みなのですが、二次抗体がAPコンジュゲートしかなく、メンブレンの再利用ができないのです。 HRPのものでケミルミであればそういった方法もあったかもしれませんが…… ケミルミでやるときの参考になります。 >おおさん >わたしならPBSTにつけて４度保存。で一次抗体溶液は回収して保存しておく。 >普段どれくらいの強さなのかによるけど、シグナルがそんなに強くないなら１次抗体溶液で１時間ほどインキュベーションし直して次のステップに進む。 なるほど、一旦反応を止めておいて（？）、再度仕上げのような形でインキュベーションして確かに反応させたということにするのですね。 これならはがれてしまった１次抗体もまたくっつきそうですね。 もうすこし募集させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.5307-4 - 2016/08/04 (木) 15:59:34 - おお わたしならPBSTにつけて４度保存。で一次抗体溶液は回収して保存しておく。 普段どれくらいの強さなのかによるけど、シグナルがそんなに強くないなら１次抗体溶液で１時間ほどインキュベーションし直して次のステップに進む。 ブロッキングは使うものによるけど、あまり長期間その中で膜を保存したくないなぁという個人的理由が２つほどあります。

(無題) 削除/引用 No.5307-3 - 2016/08/04 (木) 15:02:32 - abb 中断する必要はないと思うけど。 1. Blocking buffer（1% skim milkの方がよいかも）で二次抗体を希釈して（1/10000-1/50000）反応および検出 2. 検出できなければ洗浄してCanGet Sugnalで検出 CanGet Signalは抗体の結合性を高めるためのもので、またどちらかというと二次抗体よりも一次抗体の結合性が大事なので、二次抗体に関してはblocking bufferでも普通は問題ありません。 抗体を選べば、1% skim milkで抗体を希釈して検出しても感度に不満はありません。 まあ、抗体次第ですね。

(無題) 削除/引用 No.5307-2 - 2016/08/04 (木) 15:01:36 - mon 抗体といえども結合・解離は平衡反応なので、抗体濃度が薄まると剥がれてきますので、一次抗体を入れっぱなしで置くのが良いと思います。 ただし、もしかするとCanGet Signalではバックが高くなるかもしれません。 結合力の強い（結合したら離れない）一次抗体ならどこで止めてもさほど結果に影響しないと思います。

ウェスタンの1次抗体反応後に実験を中断したい！ 削除/引用 No.5307-1 - 2016/08/04 (木) 14:47:50 - 発注ミス いつも大変参考になっております。 ウェスタンブロットの1次抗体反応後の実験中断について相談があり書き込みます。 昨日から、IPからのウェスタンブロットをしており、CanGet Signalを用いての1次抗体反応を4° o/nで進めていました。 しかし、CanGetの第2液だけが切れてしまっていたので先日発注を欠けたのですがぎりぎり今日に間に合わず、実験の先ができない状態です。まったく情けない次第です。 1次抗体反応後、私の実験系では二次抗体の前にもブロッキング（5%スキムミルク/TBS-T）を行うのですが、この周辺のステップでどう停めるのがよいでしょうか？ 現状（1次抗体反応後）、どこで実験を中断し保存しておくのがよいか？ アイデアとしては 1．TBS-Tでの洗浄を行い、そのまま4℃で保存し、翌日ブロッキングから開始 2. 洗浄を行い、ブロッキングを4℃　o/nで行う。 3. 2.のブロッキングを0.3 % スキムミルク/TBS-Tなど、薄い条件で行う 4. 1次抗体反応をまだ続ける と言うものがあります。 「そんなことやっちゃいかんよ」とか「こうしたらいいんじゃない？」などのご意見や 「やったことある！　これで切り抜けられたよ！」という心強い経験談、お待ちしております

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