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(無題) 削除/引用 No.5268-17 - 2016/07/27 (水) 20:48:47 - ふみ cDNAの2倍希釈系列を作って2重測定。 cDNAの濃度に依存せずにバンドが現れるならばcDNAに依存しない何かが鋳型になっていると考えられる。 PCR産物長75bpは短くてイマイチだと思います。 プライマーダイマーが増えているかもしれない状況なら150bpぐらいの産物になるように再設計した方が解釈が簡単になると思います。 b-actinを増やすのに45サイクルは、極微量等の特殊な試料でないならば、多すぎます。 通常は20サイクル前後でb-actinは増えてきます。 35サイクルか30サイクルで打ち切りにするのでよいと思います。 30サイクルを超えて立ち上がるようなPCRは問題があることが多いです。

(無題) 削除/引用 No.5268-16 - 2016/07/27 (水) 10:09:54 - bko ご意見ありがとうございます。 最終目的は仰る通りこのプライマーで定量できるか?です。 目的を見失っておりました。ご指摘ありがとうございます。 今回のPCRで、目的配列を含むcDNAが適切に増幅し、negative controlで増幅しないのが確認されたらRT-PCRの装置にかけ、templateの段階希釈を行ってスタンダードカーブの範囲を決め、 その後実際のサンプルを用いて定量、という流れを考えておりました。 最初の段階で強く光るバンドがnegative controlで出てしまい、困惑していました。明らかに何かを増幅してしまっているのではないか、と思い、悩んでいて、相談した次第です。 確かに、ご指摘の通り、最初からRT-PCR装置で立ち上がりを確認すべきだと感じました。また、dimerとしても十分ありえるサイズだというご指摘もあり、それを含め、もう一度確認いたします。 本当にありがとうございます。 コンタミについても、強い先入観というご指摘、ありがとうございます。 コンタミには細心の注意を払っていると思っていましたので、先入観だ、と言われればその通りだと思います。 フィルターチップはeppendorfのものを使用しているのですが、もし別のおすすめがあれば、厚かましいですがご提示願えますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5268-14 - 2016/07/26 (火) 12:18:33 - おお >えーと、一番の目的は、今あるプライマー対で定量できるか？ なんか目的が読み取れないんですよね。qPCRで最終的に確認で流しているのか単にPCRしているのかするら分からなかった。っていうか、バンドが見えるというけど、メルティングガーブや実際のネガコンのCt値も話に出てこないしならたんなるPCRしているのかと思うとアンプリコンは７５bpだし、、、qPCRで４５まで回したいというなら、プライマーダイマーとかノンスペかどうかをまず判断するべきじゃないかなと思う。

(無題) 削除/引用 No.5268-13 - 2016/07/26 (火) 11:39:12 - pp なんか先入観が強い受け答えで心配です。 コンタミのリスクは溶液だけではなく、ピペットの可能性もあります。 フィルターチップだから大丈夫というのは単なる過信です。 エアロゾルが通ってしまうフィルターチップは実は多いのです。 ピペットが汚染されてしまっては、汚染が広がるだけです。

(無題) 削除/引用 No.5268-12 - 2016/07/26 (火) 11:26:26 - seventh 最終的にqPCRに使うなら希釈段階を作ったポジティブコントロールとNo Template ControlをリアルタイムPCR装置にかけてメルティングカーブと検量線をチェックすれば使えるかどうかの基準にはなります。

(無題) 削除/引用 No.5268-11 - 2016/07/26 (火) 10:36:44 - ぷら えーと、一番の目的は、今あるプライマー対で定量できるか？ってことだと思うのね。 で、タダのPCRでネガコンで謎のバンドが出ました。っていうことだけで、 このプライマー対を諦めるかって言うと、必ずしもそうでなくて、 定量に十分なサイクル数で特異的な増幅があって、定量性があって、 非特異増幅があったとしても、区別がつくとかすごく少ないとかで 問題にならなければ十分使えるわけ。 だからまず確認すべきは、このプライマー対が定量に適切なものかどうか。 だめだったら、その時点でボツ。大丈夫そうだったら、非特異増幅が影響しそうかどうかで判断する。 あなたの当初の質問だと、このバンドの正体はなんですか？！が主眼みたいなので、 追求したかったら、Tm測るなりシークエンスするなりでまずコンタミかそうでないか、確認したら？コンタミかどうかもわからないのに、この状態でコンタミしますか？！と言われても、見てもいないし、知らんがな。としか言えないので。 で、通常は、とりあえず使えるプライマー対を確保することを優先しますよ。ということです。

ありがとうございます。 削除/引用 No.5268-10 - 2016/07/26 (火) 09:29:05 - bko アドバイスありがとうございます。 プライマーの液へのコンタミは最も考えられることですが、 チップをフィルター付きで毎回変えていること、primer分注のチューブはスクリューキャプ使用していること、ゴム手袋、白衣を着ていることなどからコンタミする要素は極めて低く、大元の購入したprimerを50μMで希釈後、一部のみ5μMに希釈して分注保存しています。なので、5μMに分注したもののコンタミを考え、大元から再度希釈しましたが、同様のバンドが見えました。大元の希釈にはクリーンベンチで分注した、QIAGENのRNase free water をRNase free water を使用しています。 また、目的遺伝子のprimer、endogenous geneのprimer、どちらのセットでもバンドが見えることから、4本中少なくとも2本にコンタミしていることになりますが、 そうたやすくコンタミするとは思わないのですが、コンタミでしょうか? primer dimerの可能性について、 非常に高分子なdimerもできる可能性もあるのですね。勉強不足でした。ありがとうございます。 primer dimerの可能性を考えると、サイクル数を減らせば対応できるのでしょうか。それとも、もうprimerを設計しなおすべきなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5268-9 - 2016/07/25 (月) 11:25:09 - おお プライマーダイマーとは言われるけど、プライマー同士、プライマー内でのパーシャルなアニーリングにより起こる伸長によってできるもので、そういう箇所が原因になるのだから二次的な産物ができるのも想像にかたくないと思う。場合によってはプライマーだけで非常に高分子に至るまでラダーができることもある。

(無題) 削除/引用 No.5268-8 - 2016/07/25 (月) 10:36:55 - ぷら プライマーの液にコンタミしちゃってる。

ありがとうございます。 削除/引用 No.5268-7 - 2016/07/25 (月) 10:12:10 - bko primer サイズが20bpなので、ダイマーを形成しても50〜60bp程度だと考えて、サイズが大きいため、dimerではないと考えましたが、70bpほどにもなるのでしょうか。 ゲルを4.5%と濃くしていること、マーカーをlow rangeのもので25、50、75bpをはっきり見分けることができることから、もしdimerならもう少し低いバンドが見れるのではないかと思いました。

(無題) 削除/引用 No.5268-6 - 2016/07/25 (月) 10:06:53 - pp >[Re:5] bkoさんは書きました : > primer dimer についてですが、目的産物75bpにバンドがはっきりと見えていることから、 > dimerではないと考えています。 ごく一般的なprimer dimerのサイズなんだけどね なぜdimerではないと考えるのか根拠をしめしてくれる？

ご意見ありがとうござます。 削除/引用 No.5268-5 - 2016/07/25 (月) 09:46:30 - bko ご意見ありがとうございます。 primer dimer についてですが、目的産物75bpにバンドがはっきりと見えていることから、 dimerではないと考えています。 サイクル数については、TOYOBOのプロトコルに従って決めていました。 45サイクルが多いということは、30〜40サイクル程度でとどめたほうがよいということでしょうか? 予期せぬこととは、mastermixの中の何かと反応する、ということでしょうか。一つのバンドがはっきり見えているので何かしらと反応していることは間違いないと考えています。 Sybergreen法についてですが、 qPCRを行うため、前段階としてqPCRの試薬を用いて単純なPCRを行い、反応後のPCR溶液を4.5%アガロースゲルに流してEtBr染色した結果です。 目的の産物を増幅でき、ネガコンでは反応しないという最初の確認のために行いました。 ですので、立ち上がりのサイクル数などはこの実験ではわかりません。

(無題) 削除/引用 No.5268-4 - 2016/07/23 (土) 14:41:01 - おお ＞方法；Sybergreen法 これってなんだろうね。qPCRして確認の電気泳動をしているってことなんかな。。。それとも染めただけなんかな。。。

(無題) 削除/引用 No.5268-3 - 2016/07/22 (金) 23:28:50 - おお ４５サイクルは多すぎだと思います。それが原因で予期せぬ事が起こっている可能性が高いのではと思います。

(無題) 削除/引用 No.5268-2 - 2016/07/22 (金) 20:55:04 - pp primer dimer?

PCRのnegative controlにおける増幅について 削除/引用 No.5268-1 - 2016/07/22 (金) 19:16:08 - bko PCRにおけるnegative contorlの増幅についての質問です。 マウス由来細胞のcDNAからのRT-PCRを行おうとしているのですが、 negative controlである水を用いても目的遺伝子と同じサイズのバンドが検出されていることに困っています。 方法；Sybergreen法 primer;RNase free waterに溶解して保存。exonをまたぐ。スクリューキャップチューブに保存 mastermix;TOYOBO THUNDERBIRD PCR cycle 95C 60s 95C 15s, 60C 30s )x45 4C 水について；RNase free water をクリーンベンチでγ滅菌チューブに分注し、-30C保存。 この方法でprelimi実験でPCRをかけた際、水においてもはっきりとバンドが見えてしまいます。endogenous gene;β-actinにおいてもバンドが確認されています。 mastermixを新規に開封しても変わらず、 水については別の実験系PCRで増幅が確認されないことから水へのコンタミは考えにくいと思います。 また、exonをまたいでいること、マウスのDNA配列を認識していることから、自身のgDNAがなんらかの方法でコンタミしたためだとは考えておりません。 reaction mixの調製は通常の実験ベンチでゴム手袋、マスク、白衣を着用して行っております。すべてフィルター付きチップを使用しています。 コンタミ以外の非特異的な増幅について、あるいは考えられるコンタミの方法について、ご意見があればご教授願います。

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