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(無題) 削除/引用 No.5262-5 - 2016/08/03 (水) 01:27:42 - おりく坊 みなさま貴重なコメントありがとうございました。 キット購入を含めて違う固定法を試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.5262-4 - 2016/08/02 (火) 07:23:44 - protein メタノール処理は抗原性が失われることが多いので固定後の染色は難しいかもですね。 一方、膜タンパクの染色後に固定すると抗体の蛍光タンパクは変性するのでこれもまた難しいところです。 一つの案ですが、AlexaシリーズとかのChemical/Organic dyeだとMeOHに抵抗性があるので、 これらで膜タンパクの染色をして、それからMeOHで固定するのはいかがでしょう。 Phospho-flowだとこんなアプローチがありますので。 Cytobankにどんな抗原やDyeがFix後にも有効かのデータベースがあったような。

(無題) 削除/引用 No.5262-3 - 2016/07/21 (木) 18:52:52 - MP 細胞表面染色後に固定し、細胞内の蛋白をさらに染色ということですよね。 いろいろ試した中では、ThermoのFIX & PERM Cell Fixation & Cell Permeabilization Kitが最も良かったです。私の場合4色使ってHSC分画を染め分けましたが、細胞表面の染色パターンも固定前と固定後でほとんど変わりなく、きちんと分画できました。ただ少々値は張ります。

(無題) 削除/引用 No.5262-2 - 2016/07/21 (木) 11:02:49 - おお おそらく何かマーカーで分けてその集団での細胞内のものの発現を見ようとしているのだと思いますが、その分けるマーカーか何かの指標のほうが固定するとうまくいかないというような感じがします。そうするとその分けるマーカーか何かが実際何かのほうが重要だと思うのですが、それに関して情報がないのか、うまく読み取れないのか、、、 ソーティングしてから染めるなりWBするなりして比較したらどうでしょうか？

FACSでの細胞内タンパクの発現比較 削除/引用 No.5262-1 - 2016/07/21 (木) 09:08:41 - おりく坊 マウスmyeloid cellの分画間である細胞内タンパク質の発現をFACSで比較しようと思っています。 固定は１００％冷メタノール１０分のみで行っていて、免疫染色時に同様の固定法できちんとターゲットを細胞内に確認できていたため同様の方法を選択しています。 非固定サンプルでは綺麗に比較したいpopulationを分けることができるのですが、固定サンプルでは比較したいpopulationがうまく区別できなくて困っています。 細胞表面抗体は固定前、固定後の両方の条件でそれぞれ染めてみましたが、あまり変わらない印象です。 ４％PFAも試しましたがやはり分画が区別できません。 もし同様のトラブルを経験した方がいらっしゃいましたら、何かアドバイスを頂けたら幸いです。 よろしくお願いいたします。

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