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ボイルで糖鎖が取れてしまうでしょうか（ウエスタン） トピック削除
No.5243-TOPIC - 2016/07/14 (木) 13:07:55 - グリカン
お世話になります。

糖鎖の研究をしているわけではありませんが、対象とするタンパク質の糖鎖修飾をみるようにレビュアーから指摘を受けました。具体的には免疫沈降後、レクチンブロットもしくは、糖鎖とコアタンパク質の両方を一度に認識する抗体にて検出予定です。（その抗体は共同研究先から頂き物です）

糖鎖に明るいわけではない研究室内にて、糖鎖に明るくない者同士がディスカッションしていますが、その中で、免疫沈降後にSDSサンプルバッファーを加えてボイルをすると翻訳後修飾（この場合、糖鎖修飾です）はタンパク質から取れてしまわないか？という疑問が湧きました。そういったことを聞いたことがある、という程度の伝聞情報です。

抗体（scFv）が譲渡品で量に限りがあるために試行錯誤の前に皆様方に聞いてみようと、トピックを立てさせていただきました。何か些細なことでも構いませんので情報をいただけると幸いです。

共同研究者らはこの抗体を生細胞からのウエスタンには用いていないとのことで、前例があるわけではありません。どうぞ宜しくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.5243-7 - 2016/07/20 (水) 23:46:52 - サンショウウオ
訂正：脱リン酸化できるのだろうか。
↓
脱リン酸化阻害できるのだろうか。

(無題) 削除/引用
No.5243-6 - 2016/07/20 (水) 23:45:07 - サンショウウオ
　糖鎖のリン酸化は普段扱わないのですが、チロシンのリン酸化を扱ってる身としては、糖鎖の脱リン酸化酵素とか（あるかしらないのですが）が心配になります。
　糖鎖の場合でもオルトバナジン酸で脱リン酸化できるのだろうか。

(無題) 削除/引用
No.5243-5 - 2016/07/15 (金) 01:16:10 - q１２w３え４r５t６y７ういお
共有結合ですから、中性付近のbuffer中で100Cくらいで切れるというのはあり得ないと思います。。（糖鎖は通常は酵素で切断しますが、それでも付加している部位などによってはかなり切れにくくて苦労するものもあります。）

ただ高い濃度の強アルカリにさらすと糖鎖構造は壊れるかもしれません。ペプチド結合も一部切れることがあります。

一般論として翻訳後修飾は加熱は影響はないものとおもいますが、極端なpHにしないことは大切とおもいます。（水酸化ナトリウム溶液中とかそういう話として）

(無題) 削除/引用
No.5243-4 - 2016/07/14 (木) 14:28:47 - おお
化学的にかなり安定だと聞いています。

(無題) 削除/引用
No.5243-3 - 2016/07/14 (木) 13:54:04 - グリカン
サンショウウオ様
早速書き込みしていただき、有難うございます。

糖とタンパク質のセリン、スレオニンとの間は、共有結合だからとのこと、安心しました。

糖と糖の間、もしくは、糖とリン酸化の場合はどうでしょうか？
私の対象タンパク質はジストロフィンで、O結合型マンノースがリン酸化されることが知られております(O-mannosyl phosphorylation)。質問を重ねてしまい恐縮しておりますが、またお手隙の際にご意見をいただけますと幸いです。

まずはやってみようと思っています。有難うございます。

(無題) 削除/引用
No.5243-2 - 2016/07/14 (木) 13:20:01 - サンショウウオ

グリコシダーゼで酵素処理（オーバーナイト）しないと、タンパクと糖鎖の共有結合は切れないものと認識しています。

ボイルで糖鎖が取れてしまうでしょうか（ウエスタン） 削除/引用
No.5243-1 - 2016/07/14 (木) 13:07:55 - グリカン
お世話になります。

糖鎖の研究をしているわけではありませんが、対象とするタンパク質の糖鎖修飾をみるようにレビュアーから指摘を受けました。具体的には免疫沈降後、レクチンブロットもしくは、糖鎖とコアタンパク質の両方を一度に認識する抗体にて検出予定です。（その抗体は共同研究先から頂き物です）

糖鎖に明るいわけではない研究室内にて、糖鎖に明るくない者同士がディスカッションしていますが、その中で、免疫沈降後にSDSサンプルバッファーを加えてボイルをすると翻訳後修飾（この場合、糖鎖修飾です）はタンパク質から取れてしまわないか？という疑問が湧きました。そういったことを聞いたことがある、という程度の伝聞情報です。

抗体（scFv）が譲渡品で量に限りがあるために試行錯誤の前に皆様方に聞いてみようと、トピックを立てさせていただきました。何か些細なことでも構いませんので情報をいただけると幸いです。

共同研究者らはこの抗体を生細胞からのウエスタンには用いていないとのことで、前例があるわけではありません。どうぞ宜しくお願い致します。
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