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(無題) 削除/引用 No.5238-10 - 2016/07/19 (火) 22:31:27 - tracker WBで発現量を見たいというご希望には添えませんが 固定細胞でworkするなら、コントロールをしっかりとればcell ELISAでもいいんじゃないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.5238-9 - 2016/07/17 (日) 03:18:07 - asan 自作の抗体ならば、たいていはラビットポリクロだと思うんですが、ポリクロで全くウエスタンできないってのもあまりないケースのような気がしますけどね。抗原は3字構造を形成するものを用いたってことなんでしょうか？エンドのはいろいろややこしいと思うので、ウエスタンで本当に見えないのかどうかは大腸菌リコンビならそれを使ってみるとか、過剰発現細胞でタグと一緒にやってみて本当に見えないのかとか粘ってみたりしましたか？1次抗体と2次抗体の相性とか、FACSなら細胞膜タンパクかもしれませんが、それならちゃんと可溶化できてないだけとかそういう可能性もないののかな〜と思ったりもしました。ちなみに全く検出できないならば、価力が弱いだけということもあるので、1/500から1/200ぐらいの高濃度まで一度ぐらいは試してみてもいいかもしれませんね。 ちなみに免染は使えるのでしょうか？FACSで綺麗に見える抗体ならば、定量的に発現を評価するのはそもそもFACSの方が膜に存在する厳密なものを細胞ごとに見てる気もするので十分な気がしますけどね。MFIとかで出せば一応定量的に議論もできますしね。

natuve PAGE 乙 削除/引用 No.5238-7 - 2016/07/16 (土) 17:54:03 - くぁwせdrftgyふじこlp native-PAGEする際のlysis bufferとSDS-PAGEしたときのlysis bufferは同じものかな。native-PAGEに供するならば、それに適したlysis bufferの可溶化能はかなり限定的になるとおもうので、たとえば高分子量複合体や多くの膜蛋白質等は分析可能な対象からはずれてしまうなど起こりえるとおもうので、native PAGEはSDS-PAGEで見た蛋白質をそのまま未変性で見るというわけではないことは注意したほうがいいとおもう。 抗体によっては還元の有無で反応性が大きく変わる事がたまにあるので、一度、還元処理ありなしでSDSーPAGEしてみてほしい。そのときは両者のレーンの間は2レーンくらい空けて、空きレーンには還元剤なしのサンプルbufferを流す。

(無題) 削除/引用 No.5238-6 - 2016/07/13 (水) 11:40:46 - me SDS-PAGEからWestern Blottingで検出できなかったということですが、SDS化だけして非還元状態でも検出できませんか？ 還元剤を入れずにボイルもしないだけで後の操作はSDS-PAGEと同じなので簡単に検討できます。

(無題) 削除/引用 No.5238-5 - 2016/07/13 (水) 10:57:34 - おお >[Re:4] 理0さんは書きました : > おお様、 > ありがとうございます。 > 薬剤処理前後での発現量の違いをnative-PAGE後のwesternで検討できないかと考えていましたが、乱暴な方法のようです。まずどこにバンドが出てくるかはわからないですし、モノクロとはいえ、ノックアウトのサンプルを一緒に流さなければ特異的なバンドなのかノンスペなのかは分子量の情報がらは判断できませんので、判別できそうにありませんね。 乱暴とまで言いませんけど、SDSPAGEで見れないので、非変性条件下とは言えトランスファーしたメンブレン上で見れるか不思議だったのです。特異性に関しては慎重にしないといけないですけど、見れるならそれでもいいかとも思いますけど、、、やはり抗体がはんのうするのかなぁーって。 転写はメタノール使わずSDS抜きでPVDFでやるのでしょうか。そこまで徹底してなるべくネイティブな状態でというなら吸着した時点て構造が変わっている可能性もありますがまあやってみてもいいのかもしれませんけど。 あと、ネイティブで流すとコンプレックスとして流れている可能性がありますのでパーシャルなコンプレックスや、完全なコンプレックスや違う蛋白とのコンプレックスなど複数のバンドが出て来る可能性はあります。そうすると発現が見たいとするなら、ちょっと情報量が多すぎじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.5238-4 - 2016/07/13 (水) 10:27:21 - 理0 おお様、 ありがとうございます。 薬剤処理前後での発現量の違いをnative-PAGE後のwesternで検討できないかと考えていましたが、乱暴な方法のようです。まずどこにバンドが出てくるかはわからないですし、モノクロとはいえ、ノックアウトのサンプルを一緒に流さなければ特異的なバンドなのかノンスペなのかは分子量の情報がらは判断できませんので、判別できそうにありませんね。 > 抗体と反応させて抗体の位置がシフトするかをみるのですか？ 私自身は経験ありませんが、ゲルシフトアッセイのようなものでしょうか？ 抗体の位置を見る際にはどう検出するかが難しそうですね。 細胞免疫染色（パラホルムアルデヒドやメタノール固定）でも綺麗に染まってくれるんですよね。 ウエスタンで発現を見るいい方法があるといいのですが。 ありがとうございます。 >[Re:2] おおさんは書きました : > もちろん流せますけど、どうやって検出するんですか？ > > 抗体と反応させて抗体の位置がシフトするかをみるのですか？

(無題) 削除/引用 No.5238-3 - 2016/07/13 (水) 09:45:18 - おお 電荷の心配についてはBlueNativeとかマイルドな負電荷を持つデタージェントを加えることでシフトさせるという方法もあります。

(無題) 削除/引用 No.5238-2 - 2016/07/13 (水) 09:43:08 - おお もちろん流せますけど、どうやって検出するんですか？ 抗体と反応させて抗体の位置がシフトするかをみるのですか？

細胞溶解液をnative-PAGEする可能性について 削除/引用 No.5238-1 - 2016/07/13 (水) 08:20:07 - 理0 日頃から勉強させていただいております。 フローサイトに使える抗体を作製しました。ノックアウト細胞には反応しませんので、特異的なものです。今後、タンパク質の定性、定量にも用いたいためウエスタンブロットに使えるかどうかを検討しています。ですが、残念ながら通常のSDS-PAGE後のウエスタンには使えそうにもありませんでした。 生細胞のフローサイトに使えるということはnativeな構造を認識していることが示唆されます。 そこでnative-PAGEを行ってはどうかと考えています。私は昔native-PAGEを随分行っておりましたが、その際には、精製組替えタンパク質（受容体）を解析しており、リガンドを加えた時のニ量体を検出していました。 今回のタンパク質も受容体でして、過去の報告によると、native-PAGEで精製組替えタンパク質を解析している論文にたどり着きました。つまり、少なくとも組替えタンパク質の正味の表面電化はマイナスであることが予想されます。 そこで、私も細胞を1xの細胞溶解液をそのままnative-PAGEに供すれば見れるかもしれないと考えています。が、これまで細胞溶解液（トータルセルライセート）をnative-PAGEしたことがなく、そのような論文も見つけられませんでした。もちろんライセート中にはタンパク質分解酵素阻害剤を入れますし、細胞内ではその受容体単独で存在する可能性は勿論低いので、正味の表面電荷が、組替えタンパク質のそれと同じであることはないと思われます。 このような理由から、native-PAGEには期待が薄いでしょうか？ もちろん、細胞表面をビオチン化して、今回の抗体で免沈した後にHRPアビジンで検出も可能だとは思いますが、できるだけシンプルな方法で、膜表面に局在しているものだけでなく全てのトータルでのタンパク質の検出ができればと思っています。 どなたか細胞溶解液をnative-PAGEに供された方、いらっしゃいませんでしょうか？ もしいらっしゃれば、情報をシェアしていただけると大変嬉しく思います。

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