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(無題) 削除/引用 No.523-6 - 2012/05/16 (水) 22:21:46 - ab > 目的分子のリコンビナント蛋白で抗体の結合が本当にblockできるか > 現在確認中です。 リコンビナントは抗体に結合して阻害するので、その抗体が他の類縁タンパク質も認識する場合は、その結合もブロックされるでしょう。 もし、可能であれば質量分析などで確認した方が確実だと思います。 目的タンパク質のファミリー分子の中で、ホモロジーが高い分子が候補としてあれば、発現していない細胞に強制発現させて交差しないか見る、という方法もあります。 でも、ちょっと手間ですね。 メーカーによっては、全く違う分子を認識する抗体を売ってることもあるので、いくつかのメーカーから数種類の抗体を手に入れて試してみる、というのが一番簡単かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.523-5 - 2012/05/16 (水) 12:58:13 - m-tak みなさまどうもありがとうございました。 ab様、 確かにWBでの特異性については考える必要がありますので、 目的分子のリコンビナント蛋白で抗体の結合が本当にblockできるか 現在確認中です。 やま様、 RNAのグレードについては、少なくともhousekeeping他、いくつかの遺伝子では全く問題なく検出できていますので、問題ないと思っています。 スプライシングバリアントは、最初考えましたが、WBで分子量が全く同じなため、可能性は高くないのではないかと思っています。 変異によりプライマーが結合しない可能性は否定できていませんので、もっと何カ所かプライマーを設定してみる価値はあるのかもしれません。 ターンオーバーの早さも考えたのですが、本当にそんなことが用いている腫瘍組織のみで起こるのか、不安で質問させていただきました。 う様、 おっしゃるとおり、もう少し一つ一つ確認する必要があるとは思っています。 ab様にもご指摘頂いた通り、抗体の特異性については検討中です。 PCRの検出バンド、PCRが動いている、という点についても、もう一度初心にかえって確認してみます。

(無題) 削除/引用 No.523-4 - 2012/05/16 (水) 09:51:46 - う ＞こういう機構というものはしられているのでしょうか。 私はgeneralな話としては聞いたことがありません。 不勉強なだけかもしれませんが。 ただ、質問者様からの情報から考えようとすると、 私だったらこういう時に 疑って確認するところを「間違いない」と前提として断定されているため、 （例えば、抗体は特異的である、PCRで検出するバンドは間違いない、 　PCRはうまくworkしているとか） 第３者としては、全く謎としか言いようがないと思います。 もう少し冷静に基本的なところからチェックするべきなのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.523-3 - 2012/05/16 (水) 07:16:35 - やま 腫瘍組織ではターンオーバーが早い。 腫瘍組織では変異が起きているのでそのプライマーでは検出できない （スプライシングバリアントとか） RNAが腫瘍組織からきちんと抽出できていない （短いRNAばかりで、長いのが取れていないとか） とか？

(無題) 削除/引用 No.523-2 - 2012/05/16 (水) 07:16:00 - ab その抗体は、本当に目的の分子を認識しているのでしょうか。 ファミリー内でホモロジーが高いと、同じファミリーの分子を認識することが結構あります。

蛋白発現はあるのに、RNA発現が認められない場合 削除/引用 No.523-1 - 2012/05/16 (水) 06:32:15 - m-tak 調べたりしたのですが、わからないので教えて下さい。 ある分子のモノクローナル抗体を用いてウエスタンを行なったところ、 正常腎臓および別の組織由来の腫瘍では同じような濃さで目的とする分子量の部分に特異的なバンドが認められました。 それぞれの組織よりRNAを抽出し、two stepのrealtime PCRで発現量の定量を行なったところ、 腎臓については、housekeeping geneより4サイクルほど遅く検出できたのですが、 腫瘍組織の方では、housekeeping geneは同じように検出できたのに、目的分子はまったく検出できませんでした。 プライマーペアについては2種類で確認しております。 通常、蛋白が認められるのに、RNAがない、ということは考えにくいと思うのですが、 こういう機構というものはしられているのでしょうか。 腎臓については、RNAレベルで十分確認できていますので、 realtime PCRの感度（RNAの発現レベル）の問題ではないと思われるため、困っています。 どうぞよろしくご教授下さい。

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