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ATM/ATR WB 削除/引用 No.5217-16 - 2017/04/13 (木) 05:19:37 - DNA repair トランスファーは100V 60min 10%MetOH noSDS Gelは4-15% gradient gel 以上の条件で一応ATM　ATR検出できています。

(無題) 削除/引用 No.5217-15 - 2016/07/19 (火) 16:40:03 - HK Lysis bufferの変更により、バンドが確認できました。 皆さま、どうも有難うございます。

(無題) 削除/引用 No.5217-13 - 2016/07/11 (月) 17:24:29 - おお ちゃんとタンパク量が測れるプロトコールを立ててください。

(無題) 削除/引用 No.5217-12 - 2016/07/11 (月) 16:54:47 - HK おおさん、azanさん、どうも有難うございます。 蛋白抽出をstrong lysis buffer（＋phosSTOP）で行い、実験を再度行ってみようと思います。 細胞数を増やすことも考えています。

detergents 削除/引用 No.5217-11 - 2016/07/09 (土) 01:13:28 - おお >[Re:10] CDさんは書きました : > ＞電気泳動は7.5%のゲルを用いており、泳動は80Vの5分間→200Vの25分間で > > 大きい分子扱ったこと無いのであまりピンとこないのですが、PAGEしている時間短くないですか？ 使っているシステムやバッファー系などに左右されると思いますが、ちょっと短めかもしれませんけどだいたいそんなもんでしょう。泳動時間が短くってBPBがゲルの2/3程度流れたところでストップしたとしても、バンドがトランスファーされないとか検出できないとかはないと思います。リン酸化などの微妙な移動度の違いを見分けられないとかそういう分解能に劣る可能性はありますけど。 >[Re:9] asanさんは書きました : > > IRdyeならば、感覚的には特に抗体との相性が悪くなければふつうのELCplusよりも感度はやや良いぐらいの印象がありますね。特にラビット抗体との相性がいいって昔ラボの人が言ってた気がします。 指摘がありましたのでちょっと調べてみました。理想的な状況ではなかなかいい感度で見えるみたいですね。 https://www.licor.com/bio/PDF/IRquant.pdf

(無題) 削除/引用 No.5217-10 - 2016/07/08 (金) 12:20:27 - CD ＞電気泳動は7.5%のゲルを用いており、泳動は80Vの5分間→200Vの25分間で 大きい分子扱ったこと無いのであまりピンとこないのですが、PAGEしている時間短くないですか？識者の方どうでしょうか？大きいもの見たいだけだったら、フロントラインが消え去るまで待ってもいいくらいのような気もしますが。

(無題) 削除/引用 No.5217-9 - 2016/07/08 (金) 04:49:17 - asan IRdyeならば、感覚的には特に抗体との相性が悪くなければふつうのELCplusよりも感度はやや良いぐらいの印象がありますね。特にラビット抗体との相性がいいって昔ラボの人が言ってた気がします。 気になるのは非変性条件で可溶化、ってところなんですが、非変性ということはそもそもSDSとかもあんまり入ってないってことですか？SDSpageでその特殊な可溶化条件を用いる理由はなんでしょうか？いずれにせよDNAに結合するようなタンパク質の場合は非変性というか、triton程度の弱い条件で回収するとヒストン等と一緒に結構沈殿に残ると思うのでちゃんと回収できてない可能性はあるとおもいます。可能ならば、一度サンプルバッファーでsonicationとボイルするなどの全回収のプロトコールでも検出されないのかは確認すべきかな〜と思います。 300は確かにデカいですが、通常のウエットの方法でちょっと長めにトランスファーして全く見えないということもないと思うので、有名な比較的アバンダントなタンパクの抗体ならば特殊なことをしなくても見えると思いますけどね。2次抗体との相性が悪いなんてことはもちろん考えられますが。

(無題) 削除/引用 No.5217-8 - 2016/07/07 (木) 19:49:28 - HK しろさん、どうも有難うございます。 以前抗体のメーカーにも問い合わせを行いましたが、残念ながら解決できませんでした。

(無題) 削除/引用 No.5217-7 - 2016/07/07 (木) 19:47:17 - HK おおさん、どうも有難うございます。 蛋白量が測れないbufferで抽出しており、分かりませんでした。

(無題) 削除/引用 No.5217-6 - 2016/07/07 (木) 15:28:33 - しろ 抗体を購入した会社に聞いてみるのはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5217-5 - 2016/07/07 (木) 12:57:36 - おお LI-CORの蛍光のシステムですよね。なかなか蛍光ではECLPlusぐらいの感度を稼ぐのはしんどいんじゃないかなぁと勝手に思い込んでいます。 もしできるなら昔ながらのフィルムか、高感度のCCDを使ったシステムで抗体が働いているのか確認してみるのも手です。それで出るなら（その方法で確認しなくても）抗体の濃度を上げると見える可能性は出てくると思います。 ＞130kDa以上でメンブレンをカットしてPonseau染色を行っていますが、明らかなバンドは確認できませんでした。 全くバンドがありませんか？それはちょっと妙だなぁ薄いけどバンドがあってもいいような気がしますけどね。どれくらいの蛋白をのっけているんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5217-4 - 2016/07/07 (木) 10:32:12 - HK おおさん、コメント頂きましてどうも有難うございます。 BIO-RADのタンク式でWBを行っています。 メンブレンはニトロセルロースを使用しています。 抗体はCSTの製品になります。 検出はLI-CORのOdyssey Clxを使用しています。blocking bufferもLI-CORの製品です。 130kDa以上でメンブレンをカットしてPonseau染色を行っていますが、明らかなバンドは確認できませんでした。 また追加のコメントがございましたら、どうぞ宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.5217-3 - 2016/07/07 (木) 10:08:37 - PD 300kDa以上のタンパクのWBについて、ここに色々アドバイスが挙げられています。 https://www.researchgate.net/post/Transferring_high_molecular_weight_proteins_in_western_blots

(無題) 削除/引用 No.5217-2 - 2016/07/07 (木) 00:01:28 - おお メンブレンは何を使っているか、 抗体のメーカーはどこか、 転写後のメンブレンへの蛋白の移り具合は（メンブレンのほうでは）どうか、 検出キットや検出システムはなにかなど示したほうがコメントが付きやすいように思います。

WBでのATM、ATRの検出について教えて下さい。 削除/引用 No.5217-1 - 2016/07/06 (水) 19:29:08 - HK お世話になります。 大学院で研究を行っております。 私は抗腫瘍薬としてDNA合成に影響を与える化合物を研究しており、化合物暴露後のATM、phospho-ATM、ATR、phospho-ATRの変化をwestern blottingで実験をしています。 ポジティブコントロールとして、３つの細胞株に放射線を照射したライセート（非変性条件）で実験を行っていますが、上記４つの明らかなバンドが確認できませんでした。 （電気泳動は7.5%のゲルを用いており、泳動は80Vの5分間→200Vの25分間で、トランスファーは300mAの1時間で通常行っています。） ATMが350kDa、ATRが300kDaのため、トランスファーの工夫が必要と考えました。 トランファー効率を上げるため、20%メタノールから15%メタノールへ、0.02%SDSの追加、トランスファーの時間を12時間まで延長しましたが、やはり目的のところにバンドが確認できていません。 CBB染色でトランスファー後のゲルを確認していますが、ゲル内のタンパクの残存はないようです。 internal controlとしてのb-actinのバンドは確認できています。 高分子蛋白であるATM（pATM）、ATR（pATR)のwestern blottingに関して、ご存じの方がいらっしゃいましたら、お知らせ頂けると幸いです。 どうぞ宜しくお願い致します。

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