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(無題) 削除/引用 No.5215-10 - 2016/07/07 (木) 21:04:29 - wでfrgthyじゅ CO2インキュベーターに入れるなら、すくなくとも炭酸buffer系にしたほうがいいとおもう。

(無題) 削除/引用 No.5215-9 - 2016/07/07 (木) 15:34:32 - おお あと放置するのもありかもしれませんけど、どうかなぁ。。。もしあなたが求めてる条件だという検証ができるならやってみてもいいかもしれません。 乳酸などが増えて培地のpHが下がってくるとかそういう懸念はあるけど。同時に老廃物による細胞への影響というのも懸念かな。アンモニアとかも上がるんだろうか。アンモニアは毒性があります。

(無題) 削除/引用 No.5215-8 - 2016/07/07 (木) 15:10:43 - asan 一番いいのは、意図してる実験に近いことをやってる論文を数あたってそのマテメソを読んでまねする事ではないかと思います。オートファジーとかなら論文も一杯あるし、有名なラボがCNSに出してる方法もまねできるでしょう。 一般論をいえば、飢餓状態でもPBSで買うのは考えにくいし（そもそも成分が違いすぎる）HBSSをベースにしたバッファーであってももう少し色々入れてると思います。通常血清飢餓だとしても1%血清にするだけでも飢餓に近い傾向は見れますが、Helaや293なら結構維持することが可能です。 ただし、この手の飢餓実験で注意すべきなのは飢餓と称してメディウムを変えると色々な意味でメディウムチェンジ刺激が加わるのでタンパク質は当然色々動きますよ、って事。コントロールを置けばいいのかもしれませんが、それなら飢餓状態で維持した後にサプリなり血清なりを加えてリスポンスを見る方が実験としては解釈しやすいです。

(無題) 削除/引用 No.5215-7 - 2016/07/07 (木) 13:17:11 - おお 栄養飢餓条件というけれど、実験の目的などからもう少し具体化していったほうがいいような気がしてます。 例えば血清１０％入ったDMEMなどからグルタミンを抜いただけで、細胞は増えずに死んでいきます。グルタミンはあなたの考えれいる栄養のカテゴリーの中に入っていますか？血清濃度を避けるのは血清飢餓といって、増殖因子や細胞のサバイバルに関した因子を減らすといった感じの実験になりえます。 栄養として糖質を考えているならグルコースフリーの培地を買ってグルコースの量を振ってやればいいかもしれません。経験はないですがグルコース０では増えずに死ぬんじゃないかな。血清には１g/lのグルコースが入っていて、培地の組成には１ー４g/lのグルコースが入っているのは成分表をみればわかるでしょう。 また細胞増殖にはコレステロールが必要で、コレステロールがないだけでも増えなくなっちゃうだろうし、鉄が供給されないといけないので無血清ではフェリチンなど加える必要があると言われています。 まあ血液の流れが悪くなってとかいうのが念頭にあるなら、血清で５０〜１００％ In PBSで細胞が増えるなら、そこからPBS中の血清の濃度を落としていくとかいうてもとれなくもないかもしれません。 ３っつほど試してみるって書いてますが、何を持って目的の条件が得られたと結論付けるのでしょうか？

3つの検討条件 削除/引用 No.5215-6 - 2016/07/07 (木) 12:51:08 - YKK わかりやすい説明ありがとうございます。 一度血清濃度の条件検討をしたいとおもいます。 分野が普段と違うので飢餓条件の実験系を用いた論文をなかなか見つけることができません。 もし良い論文等お知りでしたら教えていただきたいです。 また、この他にPBSにてincubateする方法と、10％CSのMediumにて培養し、そのまま放置する方法と考えたのですがこの実験系についていけんなどございましたらお教えください。 宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.5215-5 - 2016/07/06 (水) 19:05:37 - 小児科医師（ゆとり教育） 私はMediumはDMEM F12 (含有：3.151 g/Lグルコース、L-グルタミン、15mM HEPES）、血清はFetal Calf Serum (Fetal Bovine Serum)を使っていました。 DMEM F12 450mlに血清を50ml加えて血清10%のMediumとして使っていました。血清1%は、DMEM F12 450mlに血清10%のMediumを50ml入れて使用しています。 血清の濃度は0%, 1%, 2%, 5%, 10%でそれぞれ培養し、増殖率などを検討して増殖はあまりしないけれど細胞死も増えないという濃度を探したところ1%でした。 細胞によっても異なるし、継代数でも変わります。Fetal Calf SerumとCalf Serumでも成長因子などの量が違いますし、同じ製品でもロットが違うと条件は変わります。饑餓状態ということでみたことがある条件は、0%, 0.5%, 1%, 2%, 5%くらいなのでいつもの培養条件も含めてその濃度で試してみて下さい。

回答いたしました、お待たせしました。 削除/引用 No.5215-3 - 2016/07/06 (水) 12:29:34 - YKK 回答ありがとうございます 早速質問について回答させていただきます。 普段使っているMedium:nacarai tesqueのDMEM（High Glucoseを用いています。 血清の種類:Calf serum 血清の濃度:10%Calf serumにしています 必要な飢餓状態の時間:時間はできるだけ長めに設定したいと思っています 必要な飢餓状態:細胞死は起こらないまたは多少死んでも生き残った細胞で評価できればいいと思っています。 普段使っているMediumに10％血清ということでよろしいでしょうか。 1％で定義されているということですがそのようにされた理由はございますか？ 差し支えなければ教えてくださいよろしくお願いします。 また、私の用いているMediumですとGlucoseが入っているため栄養飢餓状態にはならにのでしょうか？ HeLaでの血清の濃度はまた検討したいと思います。 PBSですとだめでしょうか。 質問ばかりで申し訳ありません、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.5215-2 - 2016/07/06 (水) 11:53:45 - 小児科医師（ゆとり教育） 以下の項目を提示できるともう少し詳しくアドバイスできるかもしれません。 普段使っているMedium: 血清の種類: 血清の濃度: 必要な飢餓状態の時間: 必要な飢餓状態: 最後の項目は、飢餓状態だけど増殖がみられなければいけないのか、飢餓状態で細胞死は起こらないが増殖もしない状態でもいいのか、多少なら死んでも生き残った細胞で評価ができればよいのか、という意味です。 私がやっていた方法はHK2細胞という腎尿細管細胞を普段は10%血清で培養し、血清1%を飢餓状態と定義して実験をしていましたが、もちろん細胞によって異なります。この条件での飢餓状態にすると、ほとんど増殖しないか、増殖してもわずかだけという状況で細胞死はそれほど増えませんでした。Hela細胞は強いので、1%でも増殖するかも知れません。

培養細胞の栄養飢餓条件について 削除/引用 No.5215-1 - 2016/07/06 (水) 11:16:24 - YKK 培養細胞を栄養飢餓状態においてあるタンパクの発現の挙動変化を見る実験を進めていこうと思っています。 細胞はHeLa細胞で接着細胞です。 飢餓状態をdish内で作成しようと思えばどのような条件で作っていけばいいでしょうか。 考えているのはMediumを1×PBSに変えて数時間おいた状態を考えていますが飢餓状態は細胞が死んでいく条件ですのであまり継時的に見ることができません。 長期で観れる条件やアドバイス実際に飢餓条件で実験を行ったことがある方いらっしゃれば教えてください。 実験初心者で非常に拙い文章かと思いますがどうかよろしくお願いします。

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