>[Re:7] OOさんは書きました :
> Elution with imidazole wouldn't ruin Ni resins much. If you feel Ni is eluted, you could recharge Ni ion.
勉強になります。
この方法も検討事項に入れます。
>[Re:6] asanさんは書きました :
>
> 一般的には、バッチ法よりもカラム法の方がこの手の実験の回収効率は非常に良いです。バッチ法の場合はベイトとプレイの3次元どうしの相互作用になるんですが、ビーズだけでも固定すると効率が非常によくなるんです。
そうなんですね、、、もう一度カラム法で試してみます。
> ちなみに、良くO/NでIPというプロトコールがありますが、ぶっちゃけO/Nしなくても1,2時間ぐらいで結構回収できます。4℃ O/nよりも室温1時間の方が効率が良いこともあります。というか、人によっては長すぎると悪影響すらあるっていうぐらいなので、可能であれば一度時間条件を変えてみるのも手かなあともいます。そうすれば1日で何回も吸着できるでしょう？80%回収っていうのはどうやって測定してるのかにもよりますが、そんなに悪くないきもしますが？当然上液中のタンパク質が減れば回収効率は落ちるため、それなら培養液を2倍にしてさっさとやってしまった方が最終的な回収量は増えるでしょう。
タンパク質の測定はELISAでStart Material、フロースルー、Wash、Elutionをそれぞれ測定しています。
80%出たのは1晩だけIPしたサンプルで、Elutionに80%出てくれました。
>
> ちなみに、上清の回収方法はどうやってますか？ディッシュでやるにしてもできるだけメディウムを減らして培養してぎりぎりまで粘って回収とかその辺を頑張って減らせば50mlのコニカルでもかなりの量のキャプチャーができると思いますが、それでも足りないのでしょうかね？mgオーダーで大量に必要なら、そもそも培養液で回収すること自体が力技にならざる負えないので、昆虫とか大腸菌でつくるのが一般的でしょう。
コンフにした細胞を無血清に換えてしばらくしてから回収してます。
無血清に換える際に培地量は減らす等の工夫は行っていますが、そもそも発現量が少なく(数十ng/mL程度)そちらも同時に検討はしております。
また、大腸菌や昆虫細胞ではその後の試験で使用出来ないために動物細胞を使用しています。
> 確認したわけじゃないですが、500g程度で遠心してNi-NTAがつぶれるって経験はないですけどね。それよりも、長時間4度で回しまくってるからはがれていくってことはないですかね？10回o/nを繰り返すということは単純計算でも10日ぐらいやってるならタンパクがヘタってくる可能性もあります。
タンパク質に関してはそれなりに分解、変性しづらいようなのですが
剥がれていっている可能性は十分に在ります。
皆さんの意見を踏まえ、いくつか検討してみます。 |
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