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(無題) 削除/引用 No.5206-14 - 2016/07/03 (日) 08:00:25 - おお もう一度読み返してみて、ロットチェックなんて自身でやればいいだろうにと思いますけどね、、、

(無題) 削除/引用 No.5206-13 - 2016/07/03 (日) 04:38:35 - しろ あまり考えずに思いつきですが、継代のときにその培地を取っておいて、トリプシン後にその培地と混ぜて遠心するのはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5206-12 - 2016/07/03 (日) 01:37:15 - おお http://www.jbc.org/content/204/1/379.full.pdf 以下はカルシウムなどを入れたり入れなかったりしてカルモジュリンの構造変化をみたもの。ある場所は切れにくくなるけど違う場所が切れやすくなる。トリプシンの活性が変わるというよりは、カルモジュリンの構造により立体障害。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3711069 細胞.jpで書かれているのは、多分マグネシウムなど存在下では細胞が接着したままでトリプシンの効果が発揮できないと言うことをかなりはしよって書いたような気がする。

(無題) 削除/引用 No.5206-11 - 2016/07/02 (土) 17:48:29 - み >[Re:9] ANOさんは書きました : > おしいけど、少しずれている。 > > トリプシンを失活させるのではなく、その作用を > 阻害するために、カルシウムイオンとマグネシウムイオン > を使う。詳細は > > 　http://www.saibou.jp/service/know09.php > > 阻害させておいて、遠心で減らし、薄める。 かわいそうなヒトが居るからいちおう応対しておくけど失活も阻害もしないだろうな。 添付のDSﾌｧｰﾏのくだりは笑えるね。 うーん氏の説明の通りｶﾄﾞﾍﾘﾝなどの発見の経緯くらい勉強しておいた方が良い。

(無題) 削除/引用 No.5206-10 - 2016/07/02 (土) 16:50:07 - うーん >[Re:9] ANOさんは書きました : > おしいけど、少しずれている。 > トリプシンを失活させるのではなく、その作用を > 阻害するために、カルシウムイオンとマグネシウムイオン > を使う。詳細は > 阻害させておいて、遠心で減らし、薄める。 だいぶずれてると思うよ。 ふるーい文献では、カルシウムイオンはtrypsinを安定化するとされているよ。 ２価イオンがtrypsinの活性を阻害するなら、どうして活性測定でカルシウムを含んだ溶液が使われていたの？ 2価カチオンはインテグリンとECMの接着や細胞ー細胞間接着に必須だから、細胞の種類によっては、trypsinだけだと上手く効かないこともある。 EDTAを入れる理由は、そこを緩めてtrypsinが効きやすくするため。 細胞によっては、EDTAだけで継代できるし293Tなら接着が弱いからtrypsinはいらないよ。 カドヘリンが発見された経緯を勉強してみるとよいと思う。

(無題) 削除/引用 No.5206-9 - 2016/07/02 (土) 16:16:57 - ANO おしいけど、少しずれている。 トリプシンを失活させるのではなく、その作用を 阻害するために、カルシウムイオンとマグネシウムイオン を使う。詳細は 　http://www.saibou.jp/service/know09.php 阻害させておいて、遠心で減らし、薄める。

(無題) 削除/引用 No.5206-8 - 2016/07/02 (土) 12:56:31 - AA 293やHelaなら他に使ってる知り合いがいれば、 そこで使っているロットを教えてもらうという手もあります。 あるいは代理店が教えてくれることもあります。

(無題) 削除/引用 No.5206-7 - 2016/07/02 (土) 11:49:10 - み >[Re:5] ANOさんは書きました : > うろ覚えですが、２価の陽イオンさえあればよかった > と思います。そのためPBSマイナスは駄目で、Ca2+や > Mg2+を添加したプラスであれば、トリプシン作用は > 停止できたと思います。 それでトリプシンが失活するとは思えない。単に希釈されて遠心除去した結果、継代に持ち込む量が少なくなったから大丈夫だったのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.5206-6 - 2016/07/02 (土) 10:15:26 - ANO それから冷やしてても問題ない細胞なら、 冷たい液を使うか、オンアイス。

(無題) 削除/引用 No.5206-5 - 2016/07/02 (土) 10:13:17 - ANO うろ覚えですが、２価の陽イオンさえあればよかった と思います。そのためPBSマイナスは駄目で、Ca2+や Mg2+を添加したプラスであれば、トリプシン作用は 停止できたと思います。 細胞の試験管への吸着ロスもさけたいので、BSAを少し いれておけばよいのでは。

(無題) 削除/引用 No.5206-4 - 2016/07/01 (金) 22:30:29 - おお 293やHeLaなら１０％FBSの培地の１０％ぐらいまでの量なら直接培地で希釈してそのまま培養しています。ただお手元の細胞がどのように継代されてきたかでも性質も少し異なることがあると思います。トリプシンの濃度も低いものを使ってなければ低い濃度のものを使うてもあるでしょう・ こないだこの板で２％では不十分でしたという細胞を扱っている方がいました。細胞はHUVECだったかなぁ。。。 継代使用とするディッシュから培地をとって希釈してもいいと思いますけど、そんなに死細胞とかいるんだったら培養自身何か良くないことが起こってるんではないかと、、、 何か処理後に植え替えするのなら別ですけど。

(無題) 削除/引用 No.5206-3 - 2016/07/01 (金) 18:55:50 - pろhygtfrですぁqういk 5%FBSだと十分な中和が出来なかったりして、それで10%でやってます。トリプシンインヒビターは安価で市販されていますので、それを低濃度FBS or FBS Freeのmediumnで溶かして濾過滅菌して使うこともできるとおもいます。 かなり希釈されるし、接触時間は短いので通常はあまり重大な影響はないとおもいますが、血管内皮細胞のように、もともとトリプシンに弱い細胞は、中和が不十分だとダメージがあるかもしれないので一応、注意した方がいいとはおもいます。

(無題) 削除/引用 No.5206-2 - 2016/07/01 (金) 15:25:23 - せいびんぐ 普段の培養はどの大きさでやってますか？ フラスコ？10cmディッシュ？6cmディッシュ？ 普段の継代培養で実際使うのはどのくらいで、捨てる細胞はどのくらいありますか？ もし、ほとんど捨てるだけであるなら、6-wellや24-wellで継代培養したほうが長期的に見て節約できますよ あと、結局継代するときは希釈するし培養する培地に血清がはいっているので、強い細胞だと遠心しないで希釈するだけでも問題ないことも多いです

トリプシン処理後の中和に必要なFBS濃度 削除/引用 No.5206-1 - 2016/07/01 (金) 15:04:25 - 節約大魔王 些細な疑問ですが、293やHeLaを実験に使用しています。 継代時にはトリプシン処理し、その後10% FBS DMEM ( complete medium, 以下CM)で中和後、遠心しています。今のラボでは私しか細胞培養を行っておらず、現在のFBSボトルも残り僅かで、たった私のために次のFBSのロットチェックはしていただけそうにもありません。 今あるFBSを有効に使う策を考えています。 これまでトリプシン処理の中和は、直前まで使用していたold mediumで行っていました。 ただ、中には細胞死が多かったりして、古い培地はそのまま捨てたり、ということも多々あります。そこで「トリプシン中和専用のmedium」を作ろうと考えています。 今回の質問は、その際のFBSの濃度です。1%でも十分なのか、0.1%でも十分なのかという質問です。もちろんトリプシン容量に対して何倍加えるかが重要になってきますが、だいたいトリプシンを5-10倍希釈で行うとした場合を質問したいです。 以前誤って293Tのトリプシン後の中和をPBSやOPTI-MEM1でやってしまったことがあります。その際、遠心で細胞が死ぬかなと思っていましたが、結局その少量だけをpassageしたんですが、全く問題ありませんでした。 些細な質問で恐縮しておりますが、よろしくお願い致します。

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