ある食虫植物dnaのクローニングの際の、
transformatiion後のコロニーが何度やっても生えません。
内容を説明します(不足しているところもあると思うので、必要な事があればお聞き下さい)
配列既知の食虫植物のdna断片を、
SacI、HincIIを使用して取ってきます。
と、同時に同じようにカットしたベクターも作製しました。
(平滑末端と突出末端ですが、念のためBAP処理を行っています)
その後、dna断片をPCRで増幅し、ゲル抽を行いました(QIAGENキット使用)
pnk処理をした後、酵素を60度10分で失活させ、ligationを行います。
この時確認泳動を行っていますが、最初の泳動と同じ位置にバンドが現れました。
ligationは様々な条件で、何度もやり直しています。
vectorとinsertの比は、1:1から1:10まで、1刻みで行いましたが全てでダメなようでした。
また、o/nで反応させるのと、1hで反応させるものの2パターンも試していますし、
酵素が失活していない事も確認しました。
また、トランスフォーメーションの際は
DNAを2µに対し、JM109（コンピテントセル）を20µL使用し、
onice 5分
42℃ 1分
onice 5分
の後、SOC培地で30分回復培養を行ってからプレートに撒いています。
しかし、コロニーが全く生えないのです、、
ライゲーションがうまくいってないのでしょうか、それともトランスフォーメーションの仕方が良くないのでしょうか。
ドクターの方に聞いてみても分からない、との事でした。
もうお手上げです。。。
どなたか些細なことでもいいので、疑われる原因を教えて頂けると本当に助かります。
宜しくお願い致します。 |
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