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(無題) 削除/引用 No.5183-8 - 2016/06/25 (土) 15:09:54 - SNP みなさん返答ありがとうございました。 抽出した液を再度RNase処理して、13%PEG8000、1.6MNaCl混合液でPEG沈殿をやってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.5183-7 - 2016/06/24 (金) 13:31:52 - AP RNaseでRNAを分解してもEtOH pptで除去できるほどにはなりません。 だからこそPEG pptのプロトコルがあるのです。 汎用的には20% PEG8000/2.5 M NaClを0.6 vol (final conc.: 7.5% PEG)入れてvortex (30分ほど放置）、あとはEtOH pptの要領で遠心、リンス。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC333871/ NaClではなくMgCl2の存在下、5-30% PEGでサイズを差次的に沈殿する方法もあります。

(無題) 削除/引用 No.5183-6 - 2016/06/24 (金) 12:55:06 - 中年 RNaseA処理でエタノール沈殿しないくらいの短いオリゴにまで消化しようとするのはほとんど無理でしょう。皆さんお書きになっているようにPEG沈殿するのが簡単です。 プラスミドの時と事情が違うのは、BACのコピー数が低いから回収できるDNAあたりの菌数（＝RNA量）が比較にならないくらい多いせいです。

(無題) 削除/引用 No.5183-5 - 2016/06/24 (金) 12:21:25 - おお 私もPEG沈を勧めます。書こうと思ったらAPさんがすでに指摘してました。

(無題) 削除/引用 No.5183-4 - 2016/06/24 (金) 12:16:57 - SNP >いきなりBACの精製をしたんでしょうか。 BACではないプラスミドはKitを用いて精製しており、それでは全くRNAらしいバンドは見られなかったので知りませんでした。返答ありがとうございます。 RNAの長さの情報は完全に動物細胞のtotal RNAです。それだと長いものは7kbから下にスメアに見えたので勝手に大腸菌でもそうだと思い込んでいました。 通常RNaseが効いていれば、エタ沈で落ちてこなくなるぐらいの大きさまで断片が分解すると認識していました。RNA無しのプラスミドのみの濃度を知りたいのですが、もう一度RNase処理してフェノ中エタ沈しただけでは不完全でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5183-3 - 2016/06/24 (金) 12:08:45 - おお まちがいなくRNAです

(無題) 削除/引用 No.5183-2 - 2016/06/24 (金) 11:40:46 - AP まちがいなくRNAでしょう。 >通常RNAの混入は3kbぐらいからスメアになると思うのですが、大腸菌のRNAはそのくらいに固まって存在するのでしょうか？それともtRNAだけが大量に残ってしまったのでしょうか？ご教授お願いします。 こう考える根拠がわからんのだけれど、結論を言えばRNaseだってモノヌクレオチドまで分解してくれるわけではないので、程度の違いはあっても断片は残る。取り除きたければPEG pptをする。通常のプラスミドを精製した経験があればわかることなんだけれども、いきなりBACの精製をしたんでしょうか。 RNAは非変性ゲルではいろいろな程度で二次構造をとるので、決まった移動度を示さない。3 kbくらいからスメアというのがどこから来た情報か？ BACは通常のプラスミド何かと違って一細胞1-2コピーくらいのはずだから、収量ははるかに低い、したがって相対的にキャリーオーバーされるRNAの比率は多くなる。

抽出したBACプラスミドの電気泳動 削除/引用 No.5183-1 - 2016/06/24 (金) 11:07:58 - SNP 現在、長さ200kb〜300kbほどの長さのBACを購入し、プレートにまいて、シングルコロニーを4.5mlのメディウムで一晩培養後、カラムに通すまでの作業をKitで行い、その後フェノ中エタ沈してDNAを100µlに溶かして回収しました。 回収したDNAは約3µg/µlを非常に濃く、RNAの混入を疑い電気泳動を行った所、目的のバンドも見ることが出来たのですが、こちらのバンドは薄く、100bp〜50bp以下ぐらいの所まで非常に濃いバンドが見られました。その2点以外は全くバンドが見られませんでした。Kitの試薬にはRNaseが入っているものもあったのですが、自分としてはRNAの混入を疑っています。 しかし、通常RNAの混入は3kbぐらいからスメアになると思うのですが、大腸菌のRNAはそのくらいに固まって存在するのでしょうか？それともtRNAだけが大量に残ってしまったのでしょうか？ご教授お願いします。 現在は回収したDNAを再びRNase処理し、エタ沈することを考えています。これで大丈夫でしょうか？

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