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(無題) 削除/引用 No.5182-17 - 2016/06/25 (土) 23:17:39 - yuri 現在得られている沈殿を回収するというのは難しいものですか? 正直なところ、研究室はタンパク質専門ではないので、リフォールディングに対する実績は全くありません。 そのうえで、可能なものかを教えていただきたいです。

(無題) 削除/引用 No.5182-16 - 2016/06/25 (土) 14:09:32 - yuri agg様 > どのGFP使っているかによりますけど、GFPって多量体形成するものもあって、GSTを外したことで凝集しやすくなったということないですか？ > GFPなしだと上手く行かないでしょうか。 GFPはpAC-GFP1を使用しているので、単量体であると思います。 GFPなしに関しては現在解析を行っており、沈殿が生じるかを見てみる予定です。

(無題) 削除/引用 No.5182-15 - 2016/06/25 (土) 14:05:58 - yuri mon様 > 血漿タンパクなら分泌タンパクですよね？菌体内で産生させているのでdisulfide bondが正しく形成されていないとか？それなら、 > NEB SHuffle T7 Express Competent E. coli > https://www.nebj.jp/products/detail/114 > を使ってみるとか。。 > あるいは、大腸菌でも分泌系（MBPタグ等）を使用してperiplasmから回収するとか。。 大腸菌種の変更は検討していませんでした。 一度詳しく調べてみます。 ありがとうございます。 periplasmからの回収はあまり知識がないので、一度調べてから考えてみます。

(無題) 削除/引用 No.5182-14 - 2016/06/25 (土) 13:01:05 - yuri ＠：p；おりkじゅyhgtfらq様 > この場合、糖鎖がついてないからね。血中を流れてるのとは同じじゃないよね。 今回合成しているタンパク質は糖鎖修飾を受けないタンパク質ので、正しくフォールディングされるのならば血中と同じ状態となると考えております。

(無題) 削除/引用 No.5182-13 - 2016/06/25 (土) 10:37:08 - おお GSTも４量体じゃなかったっけ。。。

(無題) 削除/引用 No.5182-12 - 2016/06/25 (土) 10:13:12 - agg どのGFP使っているかによりますけど、GFPって多量体形成するものもあって、GSTを外したことで凝集しやすくなったということないですか？ GFPなしだと上手く行かないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5182-11 - 2016/06/25 (土) 09:25:50 - mon 血漿タンパクなら分泌タンパクですよね？菌体内で産生させているのでdisulfide bondが正しく形成されていないとか？それなら、 NEB SHuffle T7 Express Competent E. coli https://www.nebj.jp/products/detail/114 を使ってみるとか。。 あるいは、大腸菌でも分泌系（MBPタグ等）を使用してperiplasmから回収するとか。。

(無題) 削除/引用 No.5182-10 - 2016/06/25 (土) 01:57:25 - 「」＠：p；おりkじゅyhgtfらq この場合、糖鎖がついてないからね。血中を流れてるのとは同じじゃないよね。

(無題) 削除/引用 No.5182-9 - 2016/06/24 (金) 14:21:04 - yuri AP様 > 血漿蛋白質は単体で存在するのでしょうか、なにか担体で運ばれているとか？ 単量体で存在します。結合タンパク質なのですが、ほとんどが未飽和の状態で血漿に存在するとのことです。 > 等電点の問題と考えるなら、なにか極端な等電点のタンパク質なんでしょうか。血液中にあるならほぼ中性で問題ないはずですね。 目的タンパク質の等電点は、結合状態では6.2, 6.5です。 GFPは5.6とされています。 PBSはpH7.4に調製していますので、可能性は低いですかね… > 単純に濃度が高すぎて溶解度を越えたとか？ > 条件が許すなら界面活性剤を加えてミセルとして分散させるとか。 今回、GST融合タンパク質として1 mg/4 mL得られています。 血漿中では20 µg/Lとのことですので、濃度が高すぎるという可能性はあるかもしれません。 しかしそうだとするのならば、GSTが結合した状態では溶解していることが不可解に思います。

(無題) 削除/引用 No.5182-8 - 2016/06/24 (金) 14:03:17 - yuri たていす様 > N-末端にシグナル配列はないのですか？ > シグナル配、があるとして、その配列は除去してあるのでしょうか？ 目的タンパク質は、本来はN末にシグナルがあります。 配列は除去しました。

(無題) 削除/引用 No.5182-7 - 2016/06/24 (金) 12:39:32 - AP 血漿蛋白質は単体で存在するのでしょうか、なにか担体で運ばれているとか？ 等電点の問題と考えるなら、なにか極端な等電点のタンパク質なんでしょうか。血液中にあるならほぼ中性で問題ないはずですね。 >このようなタンパク質の場合でも、「不溶性→ミスフォールディング」ではない可能性があるのでしょうか? 単純に濃度が高すぎて溶解度を越えたとか？ 条件が許すなら界面活性剤を加えてミセルとして分散させるとか。

(無題) 削除/引用 No.5182-6 - 2016/06/24 (金) 12:35:10 - たていす ＞タンパク質は、糖鎖修飾を受けない血漿タンパク質です。 N-末端にシグナル配列はないのですか？ シグナル配列があるとして、その配列は除去してあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5182-5 - 2016/06/24 (金) 12:12:55 - yuri AP様 > 問題のタンパク質の素性をもうすこし語ってくれねば、 タンパク質は、糖鎖修飾を受けない血漿タンパク質です。 そのため、正しくフォールディングされているのならば可溶性画分に現れていると考えているのですが… このようなタンパク質の場合でも、「不溶性→ミスフォールディング」ではない可能性があるのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.5182-4 - 2016/06/24 (金) 11:03:25 - AP >目的タンパク質の性質によると思いますが。 問題のタンパク質の素性をもうすこし語ってくれねば、

(無題) 削除/引用 No.5182-3 - 2016/06/24 (金) 10:42:02 - AP 目的タンパク質の性質によると思いますが。不溶化すなわちミスフォールディングとはかぎらないです。例えば、生体内では膜や糖鎖などと関係しながら存在するタンパク質で、それがないと正しいコンフォメーションをとれないとか、取ったとしても不溶であるとか。 GSTは親水性が高く、サイズも大きいのでしばしば不溶性のタンパク質も可溶性として発現できます。しかし、そういうのは、GSTを切り離すと可溶性のままではいられない。

追記 削除/引用 No.5182-2 - 2016/06/24 (金) 10:28:13 - yuri 例えば、タンパク質の等電点沈殿が生じているという可能性も考えられるのでしょうか? pHを変化させて可溶性画分に回収することは出来ますでしょうか?

GST融合タンパク質中GSTを切断した際に生じる沈殿 削除/引用 No.5182-1 - 2016/06/24 (金) 10:22:28 - yuri いつもお世話になっております。 大腸菌を用いてGST融合タンパク質を合成し、できたタンパク質をPreScission Protease処理したところ、沈殿が生じました。 目的タンパク質が不溶性となり沈殿したものだと考えているのですが、この沈殿を再度可溶性画分として回収し、活性化状態のタンパク質として入手することは可能でしょうか? なお、GST融合タンパク質は「GST(25 kDa)-GFP(27 kDa)-目的タンパク質(43 kDa)」として合成しております。 GSTゲルに対する結合能、および、得られたタンパク質溶液やPreScission Proteaseによって生じた沈殿における緑色発光が観察されていることから、少なくともGSTおよびGFPは正しいフォールディングをしていると考えております。 となると、目的タンパク質のみが正しくフォールディングされておらず、そのため切断により沈殿が生じたと考えてよろしいのでしょうか? それとも、GST融合タンパク質の半分以上が正しくフォールディングされていることから、目的タンパク質も正しくフォールディングされており、PreScission Proteaseによる何らかの要因によって沈殿していると考えればよろしいのでしょうか? 以下、詳細を示します。 ・pGEC-6P-1ベクターを用いたGST融合タンパク質の合成 ・大腸菌種はC41を使用 ・培養条件は、4 mL培養 (37°C, 12 hr)→3 L培養 (37°C, 12 hr)→IPTG添加 (0.3 mM, 25°C, 8 hr) ・フレンチプレスによる破砕 ・GSTゲルへの結合 (4°C, 16 hr) ・グルタチオン溶出 (1 mg/4mLのタンパク質入手) ・透析膜を用いたPBS溶液への置換 (8 hr) ・Prescission Protease処理 (0.1 µgに対して2 units使用, 溶媒はPBS, 4°C, 13 hr) PreScission Protease処理によって緑色沈殿が生じました。 よろしくお願いいたします。

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