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(無題) 削除/引用 No.5181-18 - 2016/06/25 (土) 01:53:54 - 「」＠：p；おりkじゅyhgtfらq 思いつきだけど取り敢えず書いとくから。 スタッキングゲルも切り離さずにwesternする。ウェル直下とかスタッキングゲル内に引っかかってることある。 セミドライは高分子量はかなり不向きなので、ウェットでやってみる。 ゲル濃度を下げる。 転写bufferにSDS入れる（最終濃度0.01~0.05%くらい、MeOHは10~20%） モノが抽出出来てない可能性がある。かなりありうる　なんで、抽出したサンプルをdot blotでチェックしてみる。で出来てなさそうならばlysis bufferを再検討。ハードな疎水性蛋白質だと1%鳥豚ではたぶん困難かもしれない。TXとSDSは相性悪いし。なんで直にSDS-sample buffer（ただし色抜き、還元剤抜き）で抽出してみる。この場合はそのあと要DNA剪断。 boilingはしない。 300KとかだとSDS-PAGEで理論値の分子量に見合う位置にくるかどうかわからないので、あまりそこに固執しない。 分解されてないか注意。予想よりも下の方にシグナルないですか。 上手く行ってるように見える写真載せてる論文の人にメールで実際の話を聞く。ときどき論文に書いてないことがあるので。

(無題) 削除/引用 No.5181-17 - 2016/06/24 (金) 14:09:38 - AP 等電点が高いと中性付近でタンパク質の負電荷が足りなくてトランスファしないという可能性を疑ったけれどpI 5.5なら大丈夫そうですね。等電点の高いタンパク質ではpHを上げないとトランスファしにくいということがあります 。 ただ、タンパク質全体の平均としての値なので、局所的に塩基性のドメインがあって、それがアンカーになっているという可能性もないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5181-16 - 2016/06/24 (金) 14:09:25 - 300 SAR様、 大変興味深いコメントありがとうございます。 抽出がうまくできているかを疑ったことはありませんでした。 SAR様の膜タンパク質はmulti-transmembrane domainsを持っていたのでしょうか？私のは一回膜貫通ですので、可溶化はできているものとばかり思っていました。一度ご提示いただいた方法でも抽出してみます。 > ものの名前を出せば、経験者がもの特異的なコツを教えてくれるかも。 すみませんでした。はい、CI-MPRという分子です。 抗体はmouse モノクロで、クローン名は2G11というものです。Western blotには使えるようですが、私の実験ではもっぱらIFで使用しています。IFは非常に綺麗にlate endosomesが染まります。 PD様、 ご経験に基づくコメントをいただき、感謝しております。 大変詳しく抽出方法を教えていただきありがとうございます。 また、分子量が同じタンパク質を扱われていたとのこと、ぜひトライしてみます!! 心から感謝申し上げます。 おお様、 > ゲルの濃度を６％ぐらいまで下げていいのではとおもいます。 今は自作10%で行っています。転写効率を高めるため、6-7%で行ってみます。ありがとうございます。 ゲルの厚さは0.75 mmです。 >メタノールなしのPVDFでやっているならその条件が一番いいかと思いますが、入れてないなら最低で５％位入れてもいいかもしれません。メタノールが入っているならニトロセルロースで５％、PVDFで０まで下げてもいいかもしれません。 転写bufferには20 % MeOHが入っています。 メタノールフリーの方が効率がいいのでしょうか!? 知りませんでした。 愚かなことをしていたかもしれません。PVDFを扱っていますので、0%でやってみます。 ありがとうございます。 また、裏技なるものを教えていただきありがとうございます。 >トランスファーバッファーのバッファー成分の濃度を半分にする方法です。 転写条件や時間は一緒でもいいのでしょうか・・ 調べてみます。 皆様、このような初歩的な質問に対して大変ご丁寧なご教示をいただきまして、心から感謝いたしております。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5181-15 - 2016/06/24 (金) 13:59:56 - 300 皆様、たくさんのコメントをいただき、誠にありがとうございます。 しろ様、 それでもボイルの影響は排除できないのですね。しろ様からご提示されたようにボイルなしのものもためしてみます。PVDF膜は余裕を持たせてトランスファーしています。 中年様、 やはりセミドライ式が大きく影響を及ぼしていそうですね。ありがとうございます。 私自身それほど経験はありませんが、一度試してみます。 み様、 大変興味深いご指摘ありがとうございます。 そうですね、300 kDaを見るのに10%である必要はありませんね。濃度を低くして（6-7%）転写効率を高めるようにしてみます。 AP様、 等電点は5.5付近と出ています。Flow cytometryに使える抗体ですので、nativeconformationを認識しているのだと思います。natuve PAGEを試してみてもいいかもしれませんが、total cell lysateでのnative PAGEは経験がありません・・

(無題) 削除/引用 No.5181-14 - 2016/06/24 (金) 11:19:41 - PD 280kDaの一回膜貫通型タンパクなら経験があります。 抽出は1%SDS, 4M Urea, 1mM EDTA, 150mM NaCl, 50mM Tris +protease inhibitorで行い、超音波破砕をした後、サンプルバファーを加えています。ボイルはなしです。 SDS-PAGEは5-20%のgradient gel、transferはWetで5% methanol + 0.006% SDSでon ice 100V 1h.この条件で高分子バンドがそれなりに転写されています。

(無題) 削除/引用 No.5181-13 - 2016/06/24 (金) 11:03:34 - SAR 抽出はできているんでしょうか。 転写条件をあらかた試してもうまくいかないのなら、抽出条件を疑ってみては？ 過去に、膜タンパク質のWBを試みたさいに、論文を参考にしてもうまく抽出できず、結局自分で抽出条件：界面活性剤の種類、Ureaの有無を検討（もちろん、SDS処理する際の温度と時間も）して、検出できるようになったことがあります。 ものの名前を出せば、経験者がもの特異的なコツを教えてくれるかも。

(無題) 削除/引用 No.5181-12 - 2016/06/24 (金) 09:57:07 - AP >セミドライは殆ど経験ないですが、１５Vって低くないですか？ 電圧を電極間の距離で割った値でかんがえます。

(無題) 削除/引用 No.5181-11 - 2016/06/24 (金) 09:55:42 - おお まずトランスファーが高分子で効率の良い状態にするなら、ゲルの濃度を６％ぐらいまで下げていいのではとおもいます。ちょっと扱いにくいなと思うなら７％ぐらいにすると結構楽になるでしょう。ただ自作してなければ選択肢が限られますけど。 セミドライのトランスファーなら１５ボルトぐらいでいいかと思いますが、流せる時間が限られるのでやはりトランスファーされやすい環境を作るというしか改良の余地がありません。 メタノールなしのPVDFでやっているならその条件が一番いいかと思いますが、入れてないなら最低で５％位入れてもいいかもしれません。メタノールが入っているならニトロセルロースで５％、PVDFで０まで下げてもいいかもしれません。 もう一つ裏技はあまりやったことがないのですが、トランスファーバッファーのバッファー成分の濃度を半分にする方法です。DNAなどでも早く流すのに１xじゃなくって0.5xのバッファーを使うことがありますけど、それと同じような感じです。 ゲルの厚さは0.75mmであればかなりやり方で改善ができます。

(無題) 削除/引用 No.5181-10 - 2016/06/24 (金) 09:53:47 - AP 等電点はどのくらい？ セミドライでトリスグリシンは簡易法でしょう。 旧ファルマシア、ミリポアロ、アトーなのどのサプライヤーが推奨する3液型のシステムなんかは同士のでしょう。 http://www.atto.co.jp/site/technical_info/blotting/semidryblotting

(無題) 削除/引用 No.5181-9 - 2016/06/24 (金) 09:06:33 - み >[Re:3] 300さんは書きました : > サンプルは293T細胞のトータルライセートです。（１％トリトンX100） > SDSサンプルバッファーを加え、95度、3分のボイルの後、10％SDSページを行いました。 ６，７％あたりのゲルの方が見やすいと思います。 セミドライは殆ど経験ないですが、１５Vって低くないですか？

(無題) 削除/引用 No.5181-8 - 2016/06/24 (金) 07:02:57 - 中年 うちで扱っているタンパク質の一つがそのくらいのサイズですが、セミドライだと出たり出なかったりなのでもっぱらウェットです。セミドライの時はトランスファーバッファーに薄くSDSを入れると良いと言ってた人もいましたが、その人もいつのまにかウェット派になっていたので、トリッキーなところがあったのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.5181-7 - 2016/06/24 (金) 07:01:52 - しろ 私でしたら、念のためボイルしたものとしていないもの両方作って流してみる、トランスファーするときにゲルの上の方まで（スタッキングの方まで）カバーするよう余裕を持った膜でトランスファーする、論文発表すでにされているんですよね。その研究室に問い合わせて何かコツや注意する点があるのか聞いてみる、ですかね。うちはウエットの転写ですのでセミドライは他の方のコメントを待ちたいですが、ポンソーで染めると転写されてるんですよね。発表者に問い合わせるのが確実かもですね。

(無題) 削除/引用 No.5181-6 - 2016/06/24 (金) 05:03:53 - 300 さんざんさま、 膜タンパク質があぐりやすいことは承知しています。 最初に書きましたが、このタンパク質は一回膜貫通で、ほとんどが細胞外ドメインからなっています。可溶性が高く、高温であぐる可能性は低いと考えています。

(無題) 削除/引用 No.5181-5 - 2016/06/24 (金) 05:00:12 - 300 >[Re:4] さんざんさんは書きました : > >[Re:3] 300さんは書きました : > > > SDSサンプルバッファーを加え、95度、3分のボイルの後、 >

(無題) 削除/引用 No.5181-4 - 2016/06/24 (金) 04:29:23 - さんざん >[Re:3] 300さんは書きました : > SDSサンプルバッファーを加え、95度、3分のボイルの後、

(無題) 削除/引用 No.5181-3 - 2016/06/24 (金) 03:41:26 - 300 おお様、コメントありがとうございます。 また情報を開示せず、申し訳ありません。 サンプルは293T細胞のトータルライセートです。（１％トリトンX100） SDSサンプルバッファーを加え、95度、3分のボイルの後、10％SDSページを行いました。 トランスファーはトリスグリシンバッファーにて転写（15V、75分）を行い、その後は通常のウエスタンです。転写後にはポンソーにて染色を行い、タンパク質が転写されていることは確認済みです。 やはり300でも見えないことはないですよね。。

(無題) 削除/引用 No.5181-2 - 2016/06/24 (金) 03:20:54 - おお 300ぐらいならなんとかなると思うけどなぁ。ゲルの濃度とか、バッファーとか工夫できる部分はありますけど。なんの情報も提示されていませんので、、、

巨大分子のWesternがうまくいかない 削除/引用 No.5181-1 - 2016/06/24 (金) 02:05:39 - 300 非常に初歩的な内容で大変恐縮しております。 私は約300 kDaの1回膜貫通型受容体の検出をWestern blotにて検出を試みています。 ですが、検出ができていません。二次抗体はきちんとワークしていることは確認しています。 これまでに以下のことについて予備検討してきました。 ・10 ugから100 ugまでの総タンパク量をアプライ ・還元、もしくは非還元状態での検出 ・一次抗体濃度の検討 結果は同様で、いずれもバンドは認められませんでした。 調べると、セミドライでのトランスファーは高分子領域を不得手だということを知りました。 セミドライでのトランスファーは75 minですが、これでは厳しいでしょうか？ ウエットでのトランスファーは経験があまりありませんが、ウエットをしなくてもこれまで180 kDaのband等々、セミドライ式で検出できていたので、そういった事実からセミドライで全く見えないものがウエットでみれるようになるのか？と思ってしまいます。 ポジティブコントロールはありません。 ただ、cold methanolやPFAで固定した細胞に対してIFを行うと、綺麗に、特異的に特定のオルガネラが染まります。もちろんIFがよくてwesternには不向きな抗体があることは存じ上げますが、このマウスモノクロでwesternを示している論文が数多くあり、私の何かがおかしいのだろうと思っています。もし何かお気付きの点がございましたら、どうかご指摘いただけますと望外の喜びです。よろしくお願い致します。

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