BioTechnicalフォーラム [Emeraldで増えて、ExTaqで増えない]

Emeraldで増えて、ExTaqで増えない

No.5176-TOPIC - 2016/06/22 (水) 19:46:29 - ひらぱあ

PCR反応について、質問があります。

ある生物種について、野外で多数の個体を採集し、それら全てについて
同じキット（Wizard Genomic DNA Purification Kit）を用いてDNAを抽出しています。

得られた個体ごとに、抽出したDNAにコンタミが無いか等を調べるために
EmeraldAmp MAX PCR Master Mix (takara)でPCRしたところ、多数の個体について
無事バンドが見られ、direct sequencingで配列を見ても、求めていた種の配列が得られました。

その後、実験の都合で、Ex Taq Hot Start Version (takara)を用いることになり、
Emeraldで行ったのと同じプライマーセットと同じアニーリング温度でPCRしました。
Emeraldと同じかそれ以上のバンドが出る個体もある一方で、
どういうわけか、Emeraldでしっかり出ていたバンドが著しく薄くなったり、
見えなくなったりする個体が出てきました。
（出てきたものについて、バンドのサイズに違いはありませんでした）

controlについてはEmeraldでもExTaqでも濃いバンドが出ており、
PCR反応自体は成功していると考えています。

どうしてExTaqでは増幅が見られないのか、原因がわからず、困っています。
解決法や原因を教えていただけると助かります。

よろしくお願いいたします。
　

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No.5176-4 - 2016/06/23 (木) 20:10:35 - ひらぱあ

＞たていす様、おお様

コメントありがとうございます。

得られた多数の個体について、
同じようにDNA抽出を行い、同じようにEmeraldを用いてPCRを行った結果、
同じような結果（ほぼ同じ濃さのバンド）が得られました。

このことから、ゲノムDNAに対するプライマーの適性や、濃度などのテンプレートの状態についても、
Emeraldで増幅が見られた個体の間では大差無いのだろうと考え、
プライマーセットやアニーリング温度が同じままでExTaqを用いてPCRを行いました。
その結果、バンドの濃さがバラついたわけですが、
どういった理由でEmeraldとExTaqで結果が大きく異なるのか、不思議に思っています。

同じようが経験や改善策などありましたら、教えていただけると助かります。
よろしくお願いいたします。

(無題)

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No.5176-3 - 2016/06/22 (水) 23:22:51 - おお

まあ簡単に言うとそれぞれえてふえてがあるということです。酵素じしんやついてくるバッファーなどでどんな配列は増えやすいか、アニーリング温度をどれくらいに設定するのがいいかなども変わってきます。

(無題)

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No.5176-2 - 2016/06/22 (水) 23:10:09 - たていす

>どうしてExTaqでは増幅が見られないのか、原因がわからず、
最初にEmeraldでやって出たプライマーセットだからじゃない？
Emeraldでやって出なかったら、そのプライマーセットは使わないでしょう？
だから、比較が公平じゃあないと思います。
酵素は意外にemeraldもExTaqだったりしないのかなあ？とも思いますが、どうなんでしょうか。
反応の条件(Premixの条件？)が基本的に違いそうなので、結果が違っても変じゃないでしょうね。
Ｅｍｅｒａｌｄは、簡単に安く結果を出せるという売り文句のようなので、ＥｘＴａｑでＰＣＲする条件が、最適化されていないだけじゃないかなとも思います。

Emeraldで増えて、ExTaqで増えない

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No.5176-1 - 2016/06/22 (水) 19:46:29 - ひらぱあ

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