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(無題) 削除/引用 No.5170-9 - 2016/06/20 (月) 00:16:49 - おお >[Re:8] SYBR+masterさんは書きました : > >Starting from genomic DNA or single cells this amplification yields up to 5 μg of iWGA product with fragment lengths of 10 kb and longer. > > おおさん、これランダムヘキサマーでの増幅の話です。 あ、そうでしたか。ちょっと中身が見れなかったので、結構増幅しているなぁとおもって。指摘ありがとうございました。でも質問者様はもしかしてこのことを言ってたのかなぁとかちょっと思い始めてました。 余談ですが等温の増幅で３７度とかでやられている例を上げておきます。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC48243/pdf/pnas01075-0408.pdf 制限酵素でニックを入れることでそこから鎖交換できるポリメラーゼが伸長するというのを何回も繰り返す方法ですが、制限酵素配列の制約がかかります。プライマーにdNTPでなくってNTPを一箇所いれてRNaseHでニックを入れる方法もありますね。まあこれでphi29 を使って十キロ伸びるかどうかはわかりませんけど。 > Bst LFだと、maxで10 kbくらいですね。phi29 DNA polymeraseの特徴として、信じられないくらいのprocessibiltyが有ります。初期論文で70 kb以上となっていて、それもagarose泳動での分離度がそこが限界だった頃の話です。BACも増やせるらしいので、たぶんMb位は余裕でまで増えているんじゃないかと思ってます。 ありがとうございます。またちょっとずつ勉強を重ねて知識が追いつくようになればいいなと思いました。

(無題) 削除/引用 No.5170-8 - 2016/06/19 (日) 17:15:32 - SYBR+master >Starting from genomic DNA or single cells this amplification yields up to 5 μg of iWGA product with fragment lengths of 10 kb and longer. おおさん、これランダムヘキサマーでの増幅の話です。 >ただし５、１０k伸びるかというと、、、かなり厳しいんじゃないかな。 Bst LFだと、maxで10 kbくらいですね。phi29 DNA polymeraseの特徴として、信じられないくらいのprocessibiltyが有ります。初期論文で70 kb以上となっていて、それもagarose泳動での分離度がそこが限界だった頃の話です。BACも増やせるらしいので、たぶんMb位は余裕でまで増えているんじゃないかと思ってます。 ただ、phi29は基本30-37°Cの反応なので、トリッキーな、たとえばLAMPのようなprimerでは、現状増幅できません。

(無題) 削除/引用 No.5170-7 - 2016/06/19 (日) 16:16:21 - mon >[Re:3] KKさんは書きました : > 等温反応ということは承知しています。 > 通常の増幅反応として使えないかという意味です。 やっぱり。。分かっているなら最初からそう書けば良いのに。。この場合「PCR」はＮＧです。

(無題) 削除/引用 No.5170-6 - 2016/06/19 (日) 01:48:06 - おお http://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-4939-2990-0_8 Starting from genomic DNA or single cells this amplification yields up to 5 μg of iWGA product with fragment lengths of 10 kb and longer. この話をしてるんでしょうかねぇ。。。ちょっといま中身が見れませんけど

(無題) 削除/引用 No.5170-5 - 2016/06/19 (日) 01:44:26 - おお >等温反応でspecific primerが何度もanealする、 >新しい方法を考え出したらできるかもしれません。 これに近い方法はあるにはありますね。。。現在は耐熱性ポリメラーゼで鎖交換活性があるものを使い、プライマーに若干の工夫をすることにより等温反応で増幅できるテクニックが色々考案されていますが、このコンセプトや実験例は耐熱性ポリメラーゼが世に広まる前から、あります。ただし５、１０k伸びるかというと、、、かなり厳しいんじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.5170-4 - 2016/06/18 (土) 20:50:09 - SYBR master たぶん当該例は無いです。 Specific primerで挟んで増幅しようというなら、 一度templateに着いたprimerは外れませんので論理的、 また原理的に現状では無理です。 等温反応でspecific primerが何度もanealする、 新しい方法を考え出したらできるかもしれません。 他には、target sequenceを環状化できれば、 rolling circle amplification(RCA)でできるかもしれません。 が、RCA産物は基本的にssDNAですので、Phi29 DNA polymeraseより、 Bst等の耐熱性酵素の方が、2本鎖化は上手くいくという報告だった と記憶しています。

(無題) 削除/引用 No.5170-3 - 2016/06/18 (土) 18:10:54 - KK 等温反応ということは承知しています。 通常の増幅反応として使えないかという意味です。

(無題) 削除/引用 No.5170-2 - 2016/06/18 (土) 17:05:40 - mon 耐熱性ではないよ。。

Phi29 DNA Polymerase 削除/引用 No.5170-1 - 2016/06/18 (土) 16:02:49 - KK Phi29 DNA Polymeraseについてお伺いします。 ゲノムDNAの増幅に使われているようですが、 5kb, 10kbくらいの長さの断片の増幅に使用した例があるでしょうか。 正確性が高いということで、通常のPCRに使えないかと思った次第です。 よろしくお願いします。

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