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TCRの発現量を上げる方法 削除/引用 No.5167-19 - 2016/06/22 (水) 20:50:32 - 大統領 CDさん、おおさん、 有難うございます。 PBMCはMr.フロスティのような容器にいれ、ゆっくり凍らせているようです。 CDさんが仰る通り、刺激で特定のRepertoireが増えてしまうのはこわいですね。 DNAseI無しでも試してみるのと、PMC/Ionomycin有り無しで実際にTCRが変化するかどうかをチェックしてみます。 ご助言ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.5167-18 - 2016/06/20 (月) 14:40:53 - おお >[Re:16] 大統領さんは書きました : > おおさん、 > 有難うございます。 > はい、仰る通りPMA/IonomycinでT細胞の活性化が起こり、 ということで、細胞を凍結から起こしたときのダメージなどで死ぬのが防げるから、陽性になるクローンが増えるんじゃないかと言う話で、TCRの転写活性を上げるという話とは違うのではないかなぁという指摘です。

(無題) 削除/引用 No.5167-17 - 2016/06/20 (月) 04:02:17 - CD DNAseで処理せずになんとかソートして、RT-PCRがかからないのであればそれはもはやサンプルとしてキツイような気もします。ある程度培養すれば特定のTCRレパトアを持つクローンだけ増えてしまう可能性もあるわけですし（健常人TCRレパトアとの差を見たいのであれば）。DNAseなしでRT-PCRがかかるのであればDNAseが原因であるわけで一度は検討してみたほうが良いように思います。 個人的にはFrozen PBMCを使用する際にはよく洗って、懸濁して、メッシュに通すでDoublet, Triplet問題が致命的になったことは無いです・・・。 おおさんの指摘している通り、PBMC保存にはＭｒ．フロスティみたいな容器での凍結の後に液体窒素保存が好ましいと認識してます。そのまま液体窒素とかに突っ込むとViabilityは低くなると思います。それが原因で細胞が死んでゲノムが撒き散らされている？？

(無題) 削除/引用 No.5167-16 - 2016/06/20 (月) 03:36:02 - 大統領 TK−１さん、 ご助言有難うございます。 ちなみに下記２つの大統領は私では無く、荒らしです。 ハンドルネームを固定できるといいのですが。 これからも失礼な物言いがありましたら偽物だと思ってスルーしてください。 いままでセルラインしか使ったことが無かったのですが、PBMCを融解する際は思った以上の量の細胞クランプが発生し、細胞を回収することが難しいです。DNAaseIやbenzonaseを用いて細胞クランプを溶かす方法は一般的に行われている方法のようです。おっしゃる通り二時間は長すぎるかもしれません。インキュベートの時間を検討してみようと思います。有難うございます。 CDさん、 コメント有難うございます。 DNAseI入りMediumでインキュベートしなかった際は、細胞が凝集し、ほとんど１細胞を回収できません。現在DnaseIを用いておりますがbenzonaseも強力なDNAse activityを持っているのでこれも検討してみようと思っております。 おおさん、 有難うございます。 はい、仰る通りPMA/IonomycinでT細胞の活性化が起こり、サイトカインの産生増進が起こります。 コラボレーターの方もこの点を考慮し、おそらくTCRも上がるだろうとアダバイスしたのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.5167-15 - 2016/06/20 (月) 01:53:30 - おお >[Re:1] 大統領さんは書きました : > > コラボレーターの方からPMA/Ionomycinはどうかと言われたのですが、文献を検索してみてもPMA/IonomycinでTCRの発現量が上昇するという論文は見つかりませんでした。（おそらくサイトカインの発現上昇と混同しているのではと思っております）。 > > どうか宜しくお願い致します。 T cell系はよくわかりませんが、そういうシグナルがはいったほうが、サバイバル、増殖に有利と言う事はないですか？

(無題) 削除/引用 No.5167-14 - 2016/06/19 (日) 20:52:59 - TK-1 >[Re:12] 大統領さんは書きました : > TK-1さん > > 死細胞から放出されたゲノムを切るためでございます。 1. そのために３７度で２時間もdigestする必要があるのか？ 2. strainerを通して細胞clampを除いてFicollか何かでのgradientでdead cells を除く方が細胞にマイルドなような気がする。

(無題) 削除/引用 No.5167-13 - 2016/06/19 (日) 14:15:08 - おお 凍結は徐々に冷やす方法でやってますかね。。。保存用の溶液をつかって。培養細胞を保存するように。

(無題) 削除/引用 No.5167-12 - 2016/06/19 (日) 13:04:40 - 大統領 TK-1さん 死細胞から放出されたゲノムを切るためでございます。

(無題) 削除/引用 No.5167-11 - 2016/06/19 (日) 12:13:36 - TK-1 >[Re:9] 大統領さんは書きました : > TK-1さん > > 想像された通りのことです。 何も想像していません。あなたに聞いているのです。

(無題) 削除/引用 No.5167-10 - 2016/06/19 (日) 11:10:11 - CD ちなみに2時間のコンディショニング無しでソーティングしてRT-PCRするとどうなります？

(無題) 削除/引用 No.5167-9 - 2016/06/19 (日) 09:15:34 - 大統領 TK-1さん 想像された通りのことです。

(無題) 削除/引用 No.5167-8 - 2016/06/19 (日) 07:03:28 - TK-1 >DNAaseI入りのRPMI complete media 37度で二時間インキュベートし、 これって何のため？

(無題) 削除/引用 No.5167-7 - 2016/06/19 (日) 01:05:48 - 大統領 おおさん、 有難うございます。 実はNested PCRもかけているのですが、なかなかTCRがdetectされません。。。 実験手法はこちらのNat Biotechの論文を模倣しております。 www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4337815/ 具体的に書きますと、凍結PBMC １mlを温浴で溶かし５０mlのRPMIでwashします。 RPMIを除き、DNAaseI入りのRPMI complete media 37度で二時間インキュベートし、wash後、細胞表面T cell markerで染色し、FACS でT細胞を９６ウェルに１細胞ずつ入れていきます。ウェル中にはフレッシュなRT-PCR buffer、Primerが入っており、ソーティングが終わり次第、すぐにRTPCRをかけております。 ActinなどのHouse keeping geneでRT-PCRをしますと全部のウェルで検出されますので、ソーティングが上手くいっていないということはないと思います。

(無題) 削除/引用 No.5167-6 - 2016/06/18 (土) 13:30:49 - おお 凍結したときは、そのご抽出までどのような手順でやってますでしょうか。RNAからだとRTをスペシフィックプライマーでやるとか。

(無題) 削除/引用 No.5167-5 - 2016/06/18 (土) 06:38:30 - おお nested PCR でいくらかかかるようになるかもですが、気をつけないとコンタミですべて同じものから増やしている落ちがつくかもしれないので慎重に。

TCRの発現量を上げる方法 削除/引用 No.5167-4 - 2016/06/18 (土) 04:52:09 - 大統領 おおさん、 いえ、素晴らしいご助言ありがとうございます。 実はT細胞をFACSで多穴ウェルプレートに1細胞ずつ単離し、そこでTCRβの増幅をRT-PCRで行っております。コピー数の問題からDNAよりRNAの方が良いと考えておりましたが、ゲノムからの増幅もいけるかもしれません。試してみます。 有難うございます。 CDさん、 ご助言ありがとうございます。 実は比較実験を行っておりまして、フレッシュな採れたての血液からT細胞を単離し、TCRをRT-PCRで増幅しますと、大体100細胞中95細胞はTCRのバンドが確認されます。ですが、一旦凍結してしまった細胞から同様の実験を行いますと、100細胞中30細胞程度しかバンドが確認されなくなってしまいます。長期間凍結しているとRNAの分解が起こっているようです。 フレッシュな血液を使ったらどうかと思われるかもしれませんが、病院の方での臨床研究が既に終了しており、手に入るサンプルは凍結されたPBMCしかないという状態です。 細胞を融解する際は、DMSOを抜いてから2時間ほどcomplete RPMI中でインキュベートしているのですが、もう少しカルチャーしたらRNA発現も上がるのかなと思っているのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.5167-3 - 2016/06/18 (土) 01:31:30 - CD TCRだけ増幅して読むつもりですか？それなら発現量低くても大丈夫な気がしますが。 多分、T細胞表面上のTCR発現はTranscription levelでの制御ではなくて、刺激依存的に膜表面に出たり、ひ込んだりすることで制御されているような気がするので、何かケミカルやサイトカインをふりかけると転写が亢進するようなことは余り一般的に言われていることではないと思います。

(無題) 削除/引用 No.5167-2 - 2016/06/17 (金) 22:59:48 - おお ちょっとお馬鹿な発言をしちゃうかもしれませんが、ゲノムから配列を決めようとしないのはなぜですか。

TCRの発現量を上げる方法 削除/引用 No.5167-1 - 2016/06/17 (金) 22:46:42 - 大統領 いつもお世話になっております。 早速ですが質問に入らせて頂きます。 今回、患者さんの血液からT細胞を単離し、TCRの配列を次世代シークエンサーで調べる実験をしております。 サンプルはPBMCを凍らせた状態で病院から送られており、ここからT細胞を単離しRNAを抽出しています。 ですが、実際に実験をしてみたところTCR mRNAの発現量が思いのほか低く、もう少し発現量を上昇させたいと思っております。 どなたかTCRのRNA発現量を上昇させる方法をご存知ありませんか？ コラボレーターの方からPMA/Ionomycinはどうかと言われたのですが、文献を検索してみてもPMA/IonomycinでTCRの発現量が上昇するという論文は見つかりませんでした。（おそらくサイトカインの発現上昇と混同しているのではと思っております）。 どうか宜しくお願い致します。

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