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(無題) 削除/引用 No.5159-5 - 2016/06/15 (水) 16:12:05 - AP 摘出後直ちにlysis solnに入れてホモジナイズしていても分解するようならRNAlaterは効果ないでしょうね。RNAlaterが浸透すればあとは安定であるわけですが、その前に分解が起こっているんじゃないかというのなら。 おおさんのおっしゃるように、キャリーオーバーするRNaseが多くて精製後に壊れているのもしれないですね。精製開始から精製中はRNaseが効きにくい条件でずっといるわけですから。 精製をもっと丁寧にやるとか、キャパシティーの余裕を大きく取るとか（サンプル量を減らす）、精製過程を２回繰り返すとか、したらどうでしょうか。 精製後のRNAの溶媒を100% フォルムアミド（脱イオン済みの高品質の物。ABIシークエンス用のHiDiなんかいいかと）にするという方法もあります。RNaseが効かなくなります。4 ug/uLまで濃度を上げられるので、濃い目に溶解しておけば大抵のダウンストリームの反応系では十分に希釈されるので実用上問題ありません。フォルムアミドを除去したいときはアルコール沈殿します（だいしか3倍量のEtOHだったか？)。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC334043/

(無題) 削除/引用 No.5159-4 - 2016/06/15 (水) 15:20:54 - おお 経験がないので適当なことを言っていると思って聞いてほしいのですが、RNaseが多いため、精製後も持ち込みがあり、精製したあとで壊れている可能性はないのでしょうか？それならLysisの方法で頑張っても解決にならないので。。。

マウス膵臓からtotal RNA抽出について 削除/引用 No.5159-3 - 2016/06/15 (水) 14:46:51 - st ema さん ご返信ありがとうございます。 ログは確認致しましたが、丁度な解決法が得られなかったためこの度質問させて頂いた次第でございます。 RINですが、残念ながら当研究室はバイオアナライザー等、RIN測定設備をもっておらず、確認が出来ていない状況です。 RNA laterに関しましては使用経験ございます。摘出後直ぐRNA laterに保存したsampleでもdegradationしてしまいます。 動画リンクありがとうございます。こちらも以前参考にして実験を行いましたが分解のないRNAは得られておりません。 NuGENの試薬は初耳でした。実験への導入を是非検討したいと思います。

膵臓は難しい 削除/引用 No.5159-2 - 2016/06/15 (水) 14:23:41 - ema 過去質にもあるので見て RNaseの多い臓器は難しいです。 RINはどれくらいでしょう。6くらいでしたら十分解析できます。 RNAlater、RNA スタビライザー等を使用するのも手です。 最悪NuGENの試薬で分解RNAの検出を行う、という手法もあります。 JoVE http://www.jove.com/video/51779/rna?language=Japanese

マウス膵臓からtotal RNA抽出について 削除/引用 No.5159-1 - 2016/06/15 (水) 13:53:02 - st 膵臓からtotal RNAの抽出法について質問です。 現在マウス膵臓を単離し、定量PCRによりある遺伝子の発現解析を行っています。しかし、肝心の膵臓のtotal RNAがdegradationしてしまい確かな定量を行えておりません。いくつかのkit、protocolで検討しましたが、何れもdegradationが起こってしまいます。恐らく、解剖テクニックに問題があるのではと考えておりますが、未だ原因を突き止められておりません。そこで研究経験の豊富な皆様にご教授賜りたいと思い、投稿させて頂きました。 以下に実験方法、kitについて詳細を記します。 kit:Sigma mammalian RNA miniprep kit 方法:3~5ヶ月齢マウスを頸椎脱臼し、腹腔を開き膵臓を摘出。kitに含まれているLysis sol'n(guanidine含有) 500μlと2ME 10μlを混合したMix sol'nに膵臓を入れ、バイオマッシャーを用いてhomogenize(on ice)。その後kitのprotocolに沿ってRNAを抽出。degradation checkは、glyoxalationからアガロースゲルによる泳動により検出しています。 上記以外に、kitにISOGEN �U、PARIS kitを用いた抽出においても同様にdegradationを起こしてしまいます。また、抽出後に液体窒素により凍結、直ちにLysisに溶かしてもdegradationしてしまいます。 Sigma kitを用いて肝臓よりtotal RNAを抽出したところ、こちらはdegradationしておりませんでした。幾つかの他臓器でもdegradationは起きておりません。 ご意見頂けますと幸いでございます。

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