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(無題) 削除/引用 No.5157-9 - 2016/06/14 (火) 23:22:37 - ばば おおさん 透析に関してのタイムスケジュールは 試料に対して100倍積のバッファーを 18h(o/n)→2h→2hです。 もっと厳密な時間設定は必要かもしれません。 バッファーの塩濃度も検討してみます。 たいてすさん そうですね。。。 出典は自分で調べるべきでした。 参考書まで提示してくださり、有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.5157-8 - 2016/06/14 (火) 23:16:53 - たていす 毎度のことながら、出典は自分で調べてねということで、、、 陰イオン交換体にリン酸や酢酸が継続的に吸着して、カラムを上から飽和してゆくので良くない。 陽イオン交換体にも同様にトリスやアミンが良くないと聞いたことがある。 実際には、ＤＥＡＥでリン酸緩衝液などの使用例があるので、全く不可能ということではないでしょう。 TOYOPEARL SuperQ-650M をお使いであれば、直接聞けばと思ったのですが、TOSOHのｗｅｂを見るとあまり期待できないかもしれないなと思いました。でも、聞いてみると良いですよ。 原理的なところは南江堂の「蛋白質・酵素の基礎実験法」が良いと思いますが、古い本ですので見当たらないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5157-7 - 2016/06/14 (火) 23:15:07 - おお Qは吸着力は強いはずですね。物によっては付きが悪い場合はBufferの濃度を５mMまで下げるというやり方をしている人もいます。

(無題) 削除/引用 No.5157-6 - 2016/06/14 (火) 23:11:48 - おお 透析が十分できてますか？ 平衡に達するまで数時間（４ー６時間とか）かかると言われています。

(無題) 削除/引用 No.5157-5 - 2016/06/14 (火) 22:44:33 - ばば お二方、コメントありがとうございます。 おおさん たしかにpassしたところでNaCl云々は関係ありませんでしたね、頓珍漢でした。 このサンプルは元々は硫安分画によって落としてきたものでありまして 20mMのリン酸バッファーで懸濁したものを同じバッファーで透析にかけました。 なので、イオン強度としては ほぼ20mMのリン酸のみで占められる程度ではないかと思われます。 なお、平衡化はカラムサイズの10倍量で行っております。 たいてすさん まず担体について抜けておりましたこと申し訳ありません。 TOYOPEARL SuperQ-650M を使用しております。 おおさんもおっしゃっていたように アミノ酸系の緩衝液を進められる点について 経験談等あればお話し願いたいです。

(無題) 削除/引用 No.5157-4 - 2016/06/14 (火) 22:24:31 - おお >[Re:3] たていすさんは書きました : > 陰イオン交換でリン酸緩衝液を選択するのはあまり好ましくないかもしれません。 たていすさん この詳細（リファレンスや経験談など）、後学のために教えていただけませんか？そういうことは知りませんでしたので。 あ、質問者さんはカラム平衡化してから使ってますよね。。。ってかそういう落ちはまずないか。。。

(無題) 削除/引用 No.5157-3 - 2016/06/14 (火) 22:19:13 - たていす 有識者ではありませんが、 イオン交換クロマトグラフィーのカラムもしくは担体の名称が抜けておりますが、提示すべきです。 試料も透析や脱塩で20mM リン酸緩衝液pH7.3に置き換えられていると考えて良いのか解りません。 pH7.3でpI 4.9-6.5の成分を吸着したいのでしょうから、陰イオン交換体を使っているのではないかと想像します。 陰イオン交換でリン酸緩衝液を選択するのはあまり好ましくないかもしれません。アミン系の緩衝液のほうが良いような気がします。 ＞KClでのイオン交換クロマトグラフィーに代えた方がいいのかどうか カラムで分画したあと、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べるのであれば、カリウムをたくさん含むとＳＤＳで沈殿してしまいますから、ちょっと（かなり）面倒になります。

(無題) 削除/引用 No.5157-2 - 2016/06/14 (火) 22:18:05 - おお 普通はNaCl加えるときにpHの変化は期待しませんけどね。。。 それにpass through画分に来ているなら、NaCl抜きのリン酸バッファーで吸着しなかったということだから、NaClでpHうんぬん以前の問題だと思いますけど。それに目的のものが吸着しなくとも何らかの夾雑物がついて、パーシャルに精製されることはよくあるので、インプットと精製の度合いが変わらないんであればイオン交換自体が成り立ってない可能性があると思います。使ったゲルはなんですか？最悪、 がゲルろ過のゲルをイオン交換のラベルのついた容器に（たまたま空だったので）戻したとか、、、 サンプル溶液のイオン強度が高ければつかないですが、そのサンプルはもともとどんなバッファー成分の中に溶けているのでしょうか？ リン酸バッファーが相性悪そうならTrisを使ってもいいでしょうけど、それが原因ではなさそうな気がします。 よだんですが目的のpIがどうこうというのば目安で、わたしはあまりあてにしません。

イオン交換クロマトグラフィ　緩衝液 削除/引用 No.5157-1 - 2016/06/14 (火) 19:16:50 - ばば 酵素の精製を行っている者です。 精製したい酵素と夾雑タンパク質の中で多く割合を占めるモノのpIが それぞれ6.5と4.9であったため イオン交換クロマトグラフィによって酵素タンパクを精製する予定で 展開溶出液に20mMのカリウムリン酸バッファー(pH7.3)とNaCl濃度勾配を 用いる条件で行う計画です。 そこで20mMのリン酸バッファー(pH7.3)で1MとなるようNaClを溶解させ それを元に0Mから0.1M刻みの濃度で溶出液を作成しました。 この時NaClは中性塩であるため緩衝液であれば なおさらpHは大きく変化しないと思い、pHを計測せずに クロマトグラフィーへと移りました。 （ここでpHを見ないのは常識外れでした。） 結果はタンパク質の吸着が殆どなく、pass through画分に 素の酵素液の組成とほぼ変わらない溶液が得られました。 吸着がここまで弱いのはおかしいと思い 溶出液のpHとバッファーを作成する元のストックのpHを調べた結果 NaClを溶かした溶出液のpHに異常が見られ、pH6.5〜6.9でありました。 20mM リン酸バッファーの時点ではph7.3であり KH2PO4aq、K2HPO4aqのストックでも、正常な値を示しました。 脱塩水(pH6.3)へ1Mの濃度でNaClを溶解させた際はpH6.1と リン酸バッファーほどpHの変化が生じませんでした。 イオンが4種類存在していること、PO4とClの関係などのせいなのか 勉強不足なため、この現象は当然のことなのかもしれないのですが なぜこのこのようなことが生じるのか 有識者の方にお聞きできればと思います。 現在の条件はKとNaが混在してしまうことから KClでのイオン交換クロマトグラフィーに代えた方がいいのかどうかも 併せてお聞きしたいです。 以上、よろしくお願い申し上げます。

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