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(無題) 削除/引用 No.5152-21 - 2016/06/20 (月) 17:30:56 - PS >[Re:18] M2さんは書きました : > 後学のため、可能でしたら、どのようなサンプルで実験なさっているか（動物種とか、臓器由来とか、腫瘍細胞株か非腫瘍細胞か、など）お伺いできませんでしょうか？ > > お示しの４つの遺伝子のうち、私も18SとHprt1は使っており、Hprt1でばらつきが出るのはどのような場合か、何となく分かると今後の参考になります。 お返事が遅くなり失礼しました。 加齢させたマウスと成熟マウスの肝臓サンプル間でhprt1の変動が認められました。

(無題) 削除/引用 No.5152-20 - 2016/06/20 (月) 04:00:15 - M2 トピ主さんではないのですが、TK-1さん、どうもありがとうございます。勉強になります。私も内部標準による相対定量に疑問を感じており、細胞数をあわせた上で（あるいは細胞数カウントが難しければgenomic DNA contentであわせて）external RNAを添加して相対定量という方法が、相対定量法としては現時点で最善のように感じました。 ただ、ERCC RNA Spike in Mixですが、市販だと結構なお値段なので、ちょっと考えてしまいました。また、実際に測定したい標的遺伝子のRT効率と、Spike in Mixに含まれるRNAのRT効率（の平均）は異なると予測されます。相対定量では標的遺伝子と添加コントロールでRT効率が異なっても問題ないと思うのですが、RT効率に影響する因子が、標的遺伝子と添加コントロールRNAで異なる場合は、どうでしょうか。例えば、臓器によって標的遺伝子のRTを阻害する因子がRNAサンプルに混入しやすく、その阻害因子はSpike in MixのRNAライブラリのうちの一部にしか影響しない、というような状況がもしあれば（そのような事はないのかもしれませんが）、臓器間比較では問題かもしれない気もするのですが、、、

(無題) 削除/引用 No.5152-19 - 2016/06/19 (日) 21:05:14 - TK-1 > 結局、actb, gapdh, 18s, hprtなどなどやった結果、18s以外は群間で少々の開きがみられました。Hprt1は開きが時に大きく、候補からは外しました。18sはほとんど群間で開きはない結果となったので18sがいいのかという印象です。 RNAを吸光でできて定量してそれで量を合わせているのなら、当然の結果です。total RNAのほとんどはrRNAでそのうち18Sはその大部分を占めるのですから、sample間でRTにそれほどさがなければ18Sがある範囲に収まることは容易に想像がつくことです。それに対して、他の遺伝子は動きますが、その動きはトータルRNAにしめるmRNAの割合が少ないので、細胞の状態（刺激の有無、増える細胞か増えていない細胞か、臓器ごと、細胞の大きさなど）で変化します。 > タンパクレベルの挙動と相関するのはactbなんですけどね…これはどうなんでしょうか。 上記の理由で、かつ18Sはproteinに翻訳さないので、これも当たり前の結果です。 > ちなみに臓器間比較はしておらず、各臓器は別個に解析しておりますのであしからず 最終的に細胞の機能に送還するのはトータルRNAに占めるある遺伝子の相対的な割合でなく、一細胞あたりの発現量です。ですので、こういう観点で結果を見たければERCC RNAなどのexogenous controlを細胞数に合わせて、RT前に入れてやって、RTの効率を含めてコントロールを取ることです。これは臓器ごとであろうが、細胞の刺激状態に差があっても同様なことです。もし、わかりにくければPMID23101621を読んでください。ウェスタンなんかも、本来はトータル蛋白で合わせるのでなく、細胞数で合わせるべきです。

(無題) 削除/引用 No.5152-18 - 2016/06/19 (日) 18:46:23 - M2 後学のため、可能でしたら、どのようなサンプルで実験なさっているか（動物種とか、臓器由来とか、腫瘍細胞株か非腫瘍細胞か、など）お伺いできませんでしょうか？ お示しの４つの遺伝子のうち、私も18SとHprt1は使っており、Hprt1でばらつきが出るのはどのような場合か、何となく分かると今後の参考になります。 臓器間比較に関して、qRTPCRで網羅的に臓器間での発現比較を行った結果をまとめたウェブなども見かけるのですが、実際に実験を始める前に参考にする程度であれば問題ないでしょうか？　このようなサイトでは、異なる臓器由来の腫瘍細胞株における比較や、異なる癌遺伝子変異を持つ腫瘍細胞株間の比較などもqRTPCRで行われているようですが、このような場合はどうでしょう？

質問者です 削除/引用 No.5152-17 - 2016/06/16 (木) 17:09:29 - PS 1日見なかっただけでレスが伸びていて驚きました。 結局、actb, gapdh, 18s, hprtなどなどやった結果、18s以外は群間で少々の開きがみられました。Hprt1は開きが時に大きく、候補からは外しました。18sはほとんど群間で開きはない結果となったので18sがいいのかという印象です。タンパクレベルの挙動と相関するのはactbなんですけどね…これはどうなんでしょうか。 ちなみに臓器間比較はしておらず、各臓器は別個に解析しておりますのであしからず

(無題) 削除/引用 No.5152-16 - 2016/06/15 (水) 13:11:02 - AP バラつきがないと言っても、その吸光がRNAだけによるのか？というところは大いに問題です。極端なハナシDNAの混入具合がサンプル間で大きく違うかもしれない。 Raio は目安にはなるけれど、品質を保証するものではないです。 つまり2.0より大きくずれていたらRNA以外の物質の混入が多いということは言えますが、2.0だったらそのRNAの品質が保証されるというものでなないです。

RNAの吸光度測定 削除/引用 No.5152-15 - 2016/06/15 (水) 12:52:10 - ふみ そんなにバラつきがひどかったかなと思いました。 私は吸光度を2重測定しています。 (同じサンプルをセル(キュベット)に入れ直してもう1度測定。) 何かの具合で光が散乱して、それに気づかないと困るからです。 それで、バラつきを計算してみました。 測定シリーズ1 (5サンプル) バラつきは1.51% (0から3.92%) 測定シリーズ2 (3サンプル) バラつきは3.16% (0から5.04%) 測定シリーズ3 (2サンプル) バラつきは1.65% (1.18、2.11%) 測定シリーズ4 (8サンプル) バラつきは3.45% (1.33%から6.54%) そんなにひどくはバラついてはいないようです。 (もうちょっとよくなるとよいなとは思いました。) それと、吸光度測定系のバラつきが大きかったとしても、 そのバラつきがランダムなのであれば、 多重測定の平均値は真の値に近いものなるだろうと思います。

(無題) 削除/引用 No.5152-14 - 2016/06/15 (水) 10:22:19 - AP >>例えば、吸光度計でRNA濃度を測ってもRNA量は実際にはバラつきます。測定系の精度が弱いからです。 >わたしは結構信用していますけど、、、どうなんでしょう。。。 RNA定量の誤差はあってもqPCRに致命的なほどではないと思いますけれど。 吸光度でもnanodropなんか（私も最初は懐疑的だったんですが）、昔ながらの吸光度計とは比較にならないくらい再現性が高くぶれがないし、妥当な測定値が得られています。 吸光度測定が問題なのであれば、特異的蛍光色素をかませて定量するシステムも普及して来ていますし、バイオアナライザのようなのを使う手もあるし、定量値の精度を上げることは可能です。 もんだいなのは、qPCRにかけるのがRNAではなくてそれを鋳型に逆転写したcDNAであるところが大きいです。逆転写の効率や品質（例えば平均的に長く伸びているか、それとも伸長が悪くて中断しているのが多いか）はコントロール出来ないし、あとからの定量・評価も難しいです（cDNAライブラリ（ファージベクターなどで）を作るときは32P-dNTPをまぜて、取り込み効率から逆転写効率を算定したり、泳動して鎖長の分布を確認したりしたものです）。サンプル間比較で内部標準が大きな意味を持つのは、この点だと思っています。 本題からそれましたけれど、

(無題) 削除/引用 No.5152-13 - 2016/06/15 (水) 09:27:06 - おお >例えば、吸光度計でRNA濃度を測ってもRNA量は実際にはバラつきます。測定系の精度が弱いからです。 わたしは結構信用していますけど、、、どうなんでしょう。。。 組織間の比較は何をするにしても難しいですが（WBとかでも）、Ribosomal proteinの一つがあまりぶれないとかいろいろなもので比較して結論出しているペーパーがありました。 まあ細胞一個あたりという味方もありますが、同じ細胞でも増殖中、分化した状態、細胞周期で大きさも違いますし、ほんというと何を基準にしたらいいのか突き詰めるとわからなくなります。

(無題) 削除/引用 No.5152-12 - 2016/06/15 (水) 06:26:29 - 組織間比較 リアルタイムPCRで組織間比較は禁止だと古くから言われてきたと思うのですが？確かに最近、ものの本にもそういう実験例が書いてあったりしてビックリしますね（羊土社のリアルタイムPCR本とか） Referenceで補正する意味は、1細胞数あたりの平均値にするということです。 例えば、栄養供給に関わる最大の消化器である肝臓の細胞と、後は角化上皮になるだけの運命の上皮細胞で、解凍系のGapdhが1細胞あたり同じ数存在すると思いますか？ 細胞の大きさが全然違う組織間の比較をするときに細胞骨格系のB-actinで補正する人の頭がいいと思えますか？ 常識で考えてください。 確かにそういう組織間比較の非常識な文献は出版されており、MIQEガイドラインも批判しています。リアルタイムPCRは間違った手技が横行しているのが現状です 組織間比較の可能なReferenceは理論上細胞数を反映する18Sなどだけですが、とても高濃度のため、Targetの最も発現量の低い組織を1としたとき計算上はバラつきが「大きく」なりやすいです（質問者さんのバラつきが小さくなるは勘違いです） �刧僂t法で、「TargetとRefferenceのCt値の差は5以内であるべき」とか「3以内であるべき」とか昔議論されていたのはそのため（計算上のバラつき防止策）です。これはそもそもPCR効率を2って大雑把に概算しなければいいだけの話です 例えば、吸光度計でRNA濃度を測ってもRNA量は実際にはバラつきます。測定系の精度が弱いからです。 そこでReferenceは通常複数検討します。複数のReference遺伝子が（個体差含め）同じような傾向を示していて群間に差がなければ（正の完全相関など）、それは吸光度計でバラついたRNA量を反映しています。なので、そのReferenceを選べばいいです。 マイクロアレイの全遺伝子補正と同じノリです。 あと、普通の条件でPCRやってれば、だいたいRT効率とか、ピペッティングエラーとか、そういう細かな差以上にRNA濃度の正確な定量法がない、という問題の影響のほうが結果に大きく出てくると思います。

うーん・・・ 削除/引用 No.5152-11 - 2016/06/14 (火) 00:11:47 - ふみ 「内部標準が組織間で変動していない」かどうかを実験内で示す方法が、Ct値が群間で違わないことを示すことだと考えていました。PCRのランが複数にわたるならば標準化できる共通試料を置いて補正したらよいですし、それが検量線または濃度既知試料ならもちろんそれでもよいです。これらの評価で群間のPCRの検出に違いが出るとすると、それは何故なのでしょうか？実験条件が統制できていないということなのではないでしょうか。 私の過去の実験で試料投入量が統制できないという制約があったときに、複数のハウスキーピング遺伝子のリアルタイムPCRによる検出値がパラレルになっているということでもって、これらのハウスキーピング遺伝子の何れかで遺伝子発現量を標準化できるとしたことはあります。そういう意味では、あるハウスキーピング遺伝子候補がCt値が群間で異なる場合には発現量の補正すなわち標準化に使えないと最初に書いたのはよくなかったと思います。 とはいえ、こうした場合でも、充分なサンプルサイズを用意して実験条件をきちんと統制したら、群間のCt値の平均値は揃うのですが。

(無題) 削除/引用 No.5152-10 - 2016/06/13 (月) 17:32:31 - PS わかりました！やっと納得できました。

(無題) 削除/引用 No.5152-9 - 2016/06/13 (月) 15:34:19 - seventh > その5ページを見る限りでは「内部標準に差があっても不自然ではない、むしろその値で補正した定量値が正しい」と感じるのですが… 内部標準が組織間で変動していないという前提においてはそれで正しいです。 例えばテンプレート量の違い、サンプル間の逆転写効率の差、ターゲット以外のcDNAの極端な変動などがあった場合でも内部標準との比率は変わらないので。 逆にチューブ内の絶対量（とそれに由来するCt）は変動します。 内部標準として有効かどうかを見ようとする場合は複数の内部標準候補間で比較を行う必要があります 既成品だとこんなのもあります。マニュアルを見ればどう選定するかもわかるとおもいます。 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100005983 検量線を引く場合、内部標準のCtに差があっても問題無いですが、Ctと既知のサンプル濃度が直線で相関する範囲でないと難しいです。

(無題) 削除/引用 No.5152-8 - 2016/06/13 (月) 14:27:48 - PS 手元にTOYOBOの「私にもできた　ライフサイエンス実験シリーズ　VOL.4　遺伝子発現解析編（後編）」があります。 その5ページを見る限りでは「内部標準に差があっても不自然ではない、むしろその値で補正した定量値が正しい」と感じるのですが…

(無題) 削除/引用 No.5152-7 - 2016/06/13 (月) 09:42:04 - PS >[Re:6] おおさんは書きました : > ちなみに実際に実験をされる方ですか？ドライだけのかたですか？ 実際に実験をしており、解析も行っております、しかしながら、解析も素人でしてこういう質問をしている次第です。 また、定量値としては検量線から算出された定量値を用いていますが、ハウスキーピングの場合、Ct値がどの程度サンプル間で差が出ると問題なのでしょうか。無知なもので教えていただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.5152-6 - 2016/06/13 (月) 04:18:11 - おお ちなみに実際に実験をされる方ですか？ドライだけのかたですか？

(無題) 削除/引用 No.5152-5 - 2016/06/12 (日) 21:38:21 - PS >[Re:3] ふみさんは書きました : > 2群もしくはそれ以上の群があって、群間に差があるか知りたいのだろうと推察します。 その通りです。 > ある群と別の群のCt値に差があるハウスキーピング遺伝子候補は内在性コントロールになり得ません。 そうなりますと大抵の場合は目的遺伝子の定量値=ハウスキーピングで補正値した値となりますね。若干の誤差をハウスキーピングで補正する印象でしょうか

(無題) 削除/引用 No.5152-4 - 2016/06/12 (日) 20:52:59 - おお まずピペッティングのブレとかと、比べるものの間での発現量のブレは分けて考えてください。前者やqRCRの反応液の調整の仕方などで解消することも可能です。 後者は例えばGAPDHで補正して1.3倍でしたと言われても、ふーんそうですかぐらいです。要するにGAPDHで補正して1.3倍という事実以上でも以下でもないわけです。発現がそれで上がっているという事が重要でそれが言いたい場合は違う角度で検証したりして、そのクレームを強化するしかないです。

(無題) 削除/引用 No.5152-3 - 2016/06/12 (日) 20:47:18 - ふみ 2群もしくはそれ以上の群があって、群間に差があるか知りたいのだろうと推察します。 ある群と別の群のCt値に差があるハウスキーピング遺伝子候補は内在性コントロールになり得ません。 群間に差がなかったとして、思い切って適当な数字を言ってしまうと、次のような感じなのだと思います。すなわち、元々の(組織または細胞一定量あたりの)発現量のサンプル毎の差(これを"ブレ"と仰っているのかな？)が5%ぐらいで、real-time PCRまでにartificialに生じてしまうブレが15%ぐらい。こうした状況である場合に、そのハウスキーピング遺伝子を内在性コントロールとして補正に用いる妥当性があるのだと思います。 きっともっとちゃんと説明してくれる人が現れると思いますが、自分の頭の中の整理を兼ねて書いてみました。

リアルタイムPCRにおけるハウスキーピングの挙動について 削除/引用 No.5152-1 - 2016/06/12 (日) 20:26:15 - PS 各所で議論されていることと存じますが、改めて質問させてください。 リアルタイムPCRの内在性コントロール、つまりハウスキーピングについて悩んでいることがあります。GAPDHやβアクチンも場合によってはブレることは知られていますが、果たしてPCRという実験でハウスキーピングがブレないという現象はナチュラルな現象なのでしょうか。 ピペッティングの誤差や逆転写の効率、個体差などPCRにかける以前に誤差が生じる要因は多分にあると予想します。さらに、PCRという誤差が強調されるような実験系でハウスキーピングがズレないという現象がむしろ不自然に感じるのです。さらにですが、RSP18など極めて多量に存在するgeneをハウスキーピングに据える場合、前述のような「あるべき誤差」も無視されてしまうように感じます。 ※そもそもハウスキーピングがブレないことが絶対的な前提であればハウスキーピングで補正する意味がないように感じます。ニアリーイコールで目的遺伝子の定量値=補正値となりますよね？だってハウスキーピングはブレないんですから。 そこで質問ですが、ハウスキーピングは「絶対にブレない」ことが望ましいのでしょうか、それともブレることが自然でありそれによって補正されるデーターが正確である可能性が高いのでしょうか。

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