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(無題) 削除/引用 No.5146-19 - 2016/06/15 (水) 15:58:23 - AP >ゲルカットはなるべく手早くやってるつもりではいるのですが、確かにゲル抽した後の濃度はnanodropで確認してみても極端に落ちてしまってますね(仕方ないとはいえ) 蛇足ですが、 収量の低下はUV照射のせいではありません。 UVによってDNAが消えるわけでも粉々に分解するわけでもないです。 問題はDNAの光化学反応で、UVによってピリミジンダイマーができることが形質転換効率を著しく下げます。クローニングに使わせる宿主の多くがRecA-であり、ピリミジンダイマーを修復することができず導入されたプラスミドの複製ができません。

(無題) 削除/引用 No.5146-18 - 2016/06/11 (土) 17:45:54 - AP >決定的なのが、ligation産物を泳動したときに、vectorとinsertの２つのバンドが出てきてしまうという点です。。。 先にも書きましたが、希望のライゲーション産物は大量にできるとは限らず、泳動では反応後の変化が認められないのも普通です。大部分がライゲーションしないまま残っていてもわずかでものぞみの産物ができていれば目的は達するという実験ですから。 ただ書かれている実験デザインでは、インサート同士の重合が見られるはずで、それが顕著に観察されないというのは、末端処理が十分に効いていない可能性を示しています。合成グレードなんかにもよるかもしれないですが、プライマーに設計した制限酵素サイトは足場を十分につけてもなお、切れにくいものです。PCR産物の両末端を制限酵素で切ってライゲーションしてみると、かなり過剰な消化をしないと重合産物がみえてこないし、  すべてのDNAを重合するまで持っていくのはまず無理です。でも、ごく一部でもライゲーション可能になっていれば良いと考えます。 ともあれ、PCR産物の制限酵素処理は過剰量の酵素でやったほうが良いです。 PCRのあと制限酵素処理の前にどのような精製をしていますか？PCR酵素やヌクレオチドが残っていると消化末端が潰れてしまう可能性があります。PCRのあと長時間放っておくと末端の削れこみも進みますしね。

(無題) 削除/引用 No.5146-17 - 2016/06/11 (土) 15:10:19 - pppr >[Re:13] Iauさんは書きました : > 向きが正しいものをSacIで処理してself ligationする、というのが > よく分からなくて、申し訳ないんですけど、もう少し教えて頂きたいです。。。 PCR産物 Blunt----SacI--Insert--Blunt ベクター ------SacI----HincII (GTYRAC)-------- だとして、ベクターをHicIIで処理すると、 ------SacI----GTY RAC-------- になりますね。 そこにPCR産物をblunt-end ligationでいれると、 ------SacI----GTY----SacI--Insert--RAC-------- と ------SacI----GTY--Insert--SacI----RAC-------- の2種類ができます。 上の方が正しい向きなので、このプラスミドを制限酵素の切断パターンから選択して、SacIで処理してself ligationすると欲しいものがえられます。 2回形質転換しないといけないので、ちょっと面倒ですけどひとつの方法として。

(無題) 削除/引用 No.5146-16 - 2016/06/11 (土) 08:34:04 - おお PCRプロダクトのなにかうまく行ってないものが微妙に混じっていて邪魔している可能性を考えると、Tmなどを上げて条件を厳しくしていって、なるだけかからなくなる手前のTmなどの条件でPCRしたほうが無難です。 PCRプロダクトは制限酵素でキルにしろ切らないにしろ電気泳動で切り出しするほうがいいです。 HincIIサイトにあなたのインサートをブラントで入れても十分目的が果たせるプラスミドが得られるならプランBとして平行してやればいいかなと思います。 やり方は色々あって、HincIIできったプラスミドを脱リン酸化せずにPCRプロダクト（こちらもリン酸化が必要ない）をなるだけ大過剰入れます。プラスミドにたいして１００倍以上。一様割合を数十倍から数約倍で振ってもいいでしょう。その割合でライゲーションして、割合の高い方でコロニーができているクローンから調べていけばいいです。割合をあげるとトランスフォーメーションの効率が落ちてきて、インサートのはいる効率が上がります。なのでトランスフォーメーションの効率が落ちてきているところがポジティブのクローンが増えているサインともいえるでしょう。 PCRプロダクトはリン酸化してないので、タンデムに入ったクローンはないはずです。リン酸化していたとしてもそんなにかんたんにタンデムに入るものでもないですけど。 PCRぷとダクトがあまりにも長かったらちょっと難しくなってきますけど、１キロぐらいまでだったらまあできるかと思います。２キロだとだめかと言われると、、、できるかもしれないね。。。

(無題) 削除/引用 No.5146-15 - 2016/06/11 (土) 06:12:16 - mon 制限酵素の活性は問題ない、UVの当てすぎは気を付けているとして、各ステップの検証を行いましょう。 インサート（制限酵素+PNK処理）がLigation可能な状態であることを調べるために、インサートのみをライゲーション後泳動して、ラダー状態（もしくは長鎖化）になることを確かめると良いです。 ベクター上のSacI/HincII部位はそれぞれの制限酵素で切れる程度に離れていますよね。 また反応条件は、TA bufferまたはNEB#4+BSA(CutSmart)なら同時切断（+BAP処理）出来るようです。BAP処理後はフェノール抽出か、カラム精製してBAPを除去していますか？ 希にインサートとベクターの相性？で目的の方向にLigationしたプラスミドが不安定で、クローンが取れないこともあります。菌株を変えるかベクターを変えると成功することがあります。

(無題) 削除/引用 No.5146-14 - 2016/06/10 (金) 23:06:24 - おお PCR末端は酵素できれにくいのでそれがネックになってるのかな。。。 PCRの最後のサイクルが終わったあと７２度で５分程度の処理をしてますかね。それがないと末端がきれいに揃ってないことが多いようですが。 すでに指摘があるようにプラスミド末端がセルフでライゲーションされないようになってますので、プラスミドを脱リン酸化せず、PCRプロダクトも制限酵素出来ってゲルで精製してきたものを（リン酸化必要なし、してもいいけど）ライゲーションするとステップが省略されて楽でしょう。 コンピテントの効率はどの程度ですか？

(無題) 削除/引用 No.5146-13 - 2016/06/10 (金) 22:32:27 - Iau >ppprさん PCR酵素はKOD plusというものを使っています。 ネットで調べた限りでtdt活性はないと思います。 SacIカット部位にはたしか、6塩基ほど余分についた状態になるようにプライマーを設計しているはずです。 vectorのBAPなし、insertのリン酸化なしは上手くいきそうな気がしてます やってみます！ 向きが正しいものをSacIで処理してself ligationする、というのが よく分からなくて、申し訳ないんですけど、もう少し教えて頂きたいです。。。

(無題) 削除/引用 No.5146-12 - 2016/06/10 (金) 22:16:51 - Iau >APさん ゲルカットはなるべく手早くやってるつもりではいるのですが、 確かにゲル抽した後の濃度はnanodropで確認してみても極端に落ちてしまってますね(仕方ないとはいえ) もう少し効率的にやる方法を考えてみたほうがいいかもしれませんね。。。

(無題) 削除/引用 No.5146-11 - 2016/06/10 (金) 21:14:10 - pppr なるほど あくまで確認ですけど、PCR酵素はTdT活性のないものを使用し、SacI切断配列の5'側に数塩基追加がある状態ですか？ ひとまず、もう指摘がありますがベクターの脱リン酸化処理とPCR産物のリン酸化なしが一番簡単。インサートなしベクターのみをコントロールに使えば、問題ないです。 あとは、ベクターをHincIIだけで処理して平滑末端のまま入れてしまうのも簡単。向きが正しいものをSacIで処理してself ligationすれば同じものがとれます。脱リン酸化とリン酸化が面倒なら、TAクローニングでもよいかと

(無題) 削除/引用 No.5146-10 - 2016/06/10 (金) 21:07:45 - AP ゲル抽出の時、UV当てすぎってことはない？ 全くligationしなくても、バックグラウンドとして結構コロニーが出るものだけど、それすら出ないような時はUVのせいだったりする

(無題) 削除/引用 No.5146-9 - 2016/06/10 (金) 20:54:15 - Iau >ふみさん 説明不足ですみません！ 形質転換は実はやっています。コロニーが毎回2、3個、もしくは1個も出ないという状況です。

(無題) 削除/引用 No.5146-8 - 2016/06/10 (金) 20:53:01 - Iau >APさん 末端のデザイン、処理は、 ドクターの方に一緒に見て頂いたので恐らく大丈夫だと思います。 確かにその条件ではやった事ないですね。。。 ありがとうございます、試してみます！

(無題) 削除/引用 No.5146-7 - 2016/06/10 (金) 20:47:05 - Iau >APさん 形質転換も行っています！ コロニーが毎回2、3個もしくは全く出ない、といった状況です。 また、コロニーPCRを行ってみても、目的のバンドが出てこないです。 形質転換が上手くいかない、というのも ligationの失敗を疑う理由の１つではあるのですが、 決定的なのが、ligation産物を泳動したときに、 vectorとinsertの２つのバンドが出てきてしまうという点です。。。 やはりligationに問題ではないかと 思うのですが、どうでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.5146-6 - 2016/06/10 (金) 20:43:27 - ふみ ligation反応後に、電気泳動することでなく、形質転換の成否判定すること、に1票。

(無題) 削除/引用 No.5146-5 - 2016/06/10 (金) 19:56:00 - AP ligation反応は堅牢ですが、もちろん末端のデザインや処理なんかが不適当ならだめです。 ベクターは脱リン酸処理無し、インサートのリン酸化無しでやってみたらどうですか？

(無題) 削除/引用 No.5146-4 - 2016/06/10 (金) 19:50:38 - AP ligation産物のなかで、のぞみの環状DNAはごく一部でしかないので、電気泳動でチェックしても有用な情報は得られません。電気泳動で見えないくらいの（pg オーダーとか）でものぞみの環状DNAができていれば、二桁くらいの形質転換体を生じさせるのに十分なはずです。 形質転換はしていないんですか？形質転換が失敗したからligationの失敗を疑っているのでしょうか？　経験上、形質転換体が得られないとき、ligation反応の問題であることはまれです。

(無題) 削除/引用 No.5146-3 - 2016/06/10 (金) 19:40:48 - Iau ＞ppprさん ごめんなさい！ 説明を間違えていました。 増幅産物をsacIで処理しており、その増幅産物に対してHincIIは使用していませんでした。 なので、insertは、片側が増幅したままの平滑、もう一方はSacIで切った状態になっているはずです。

(無題) 削除/引用 No.5146-2 - 2016/06/10 (金) 19:32:40 - pppr PCRは何を増やすのでしょう？ SacIとHincIIで処理したDNA断片をPCR？ PCRしたampliconをSacIとHincIIで処理？

ligation 失敗 削除/引用 No.5146-1 - 2016/06/10 (金) 19:23:12 - Iau ある食虫植物dnaのクローニングの際の、 ライゲーションが何度やってもうまく行きません。 内容を説明します(不足しているところもあると思うので、必要な事があればお聞き下さい) 配列既知の食虫植物のdna断片を、 SacI、HincIIを使用して取ってきます。 と、同時に同じようにカットしたベクターも作製しました。 (平滑末端と突出末端ですが、念のためBAP処理を行っています) その後、dna断片をPCRで増幅し、ゲル抽を行いました(QIAGENキット使用) pnk処理をした後、酵素を60度10分で失活させ、ligationを行います。 この時確認泳動を行っていますが、最初の泳動と同じ位置にバンドが現れました。 ligationは様々な条件で、何度もやり直しています。 vectorとinsertの比は、1:1から1:10まで、1刻みで行いましたが全てでダメなようでした。 また、o/nで反応させるのと、1hで反応させるものの2パターンも試していますし、 酵素が失活していない事も確認しました。 ドクターの方に聞いてみても分からない、との事でした。 もうお手上げです。。。 どなたか些細なことでもいいので、疑われる原因を教えて頂けると本当に助かります。 宜しくお願い致します。

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