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(無題) 削除/引用 No.5144-6 - 2016/06/10 (金) 08:39:47 - TS 私(最近は自分では実験しにくくなり、私の学生は。。ですが)は、基本的にすべてPonceauSさせて、スキャンしています。エミさんもおっしゃるように、染色後にクリアファイルに入れてスキャンしていますが、そんなににじむことが気になりませんが、なにか違いがありますかね。 PoncesuSは少しでも界面活性剤が残っているとかなり染色も悪くなるけど、水ではあまり流れないと思っているんですが。 うちでは、転写後に少なくとも５分３回のMilliQで洗浄した後に、染色しています。水に入れている限り、多少染色が薄くなってもにじむということはあまり感じません。それと、染色後にあまり一生懸命洗浄しないで、少しピンクがかったくらいの溶液に沈めています。スキャンが終わったら、TBSTで洗います。 これが毎回必須かといわれるとそんなことはないと思っていますが、 レビューアーのコメントには、彼らの個人的な好みや思い込みが加わってきますから、まぁ仕方ないと思うしか。 学生にやらせるのは勉強のためとか、あとでそれを見せてもらいたい時があったりするので。かかる時間は長く見積もってもプラス３０分以内と思うので、学生ならいいかなぁと。

(無題) 削除/引用 No.5144-5 - 2016/06/10 (金) 06:05:37 - おお トランスファーがうまく行っているか、ゲルのコンディションが悪くって途中から変に流れてないかなど確認したほうがいいことがそれなりにありますから、大抵の場合メンブレンは染めることにしています。 確認できればイメージを保存しなくていいのかという点については各研究者の判断にまかせますが、保存しなければトランスファーはうまく行ってましたと言っても示すものがないというのは事実です。 それとは別に複数のインターナルコントロールをなるべく取るというのは、まあやれば説得力がありますが、蛋白の安定性、量などから言って、ある程度分解していてもインターナルコントローるとして使う蛋白は安定で大量にあるからと言われればトータルの蛋白の泳動パターンも必要と考える人もいるでしょう。 トータルでみて計算をどうするのかと言うのはいろいろあると思いますが、タンパク量を合わせているわけだからそれの確認で、目的のバンドのこさだけで計算するという考え方も成り立ちます。ぽんぞー、CBBにしても定量性はありますのでうまくやれば１０％ぐらいの違いは見れると思います。 ポンゾーでイメージのとり方ですが、たしかに滲んてきて苦労します。わたしもいい方法があればと、、、ペーパータオルで受けから軽く叩いて、即座に水分を除くとかやってはいますけど。またPVDFならアミドブラックって言う手もあるかと思いますが、だからどうなるかと言われると、、、

(無題) 削除/引用 No.5144-4 - 2016/06/10 (金) 00:31:20 - asan ごく一般的なウエスタンなら普通はそこまで毎度やることはないと思いますが…コメントされた特別な理由があったりするんでしょうか？そのためのインターナルコントロールだし、CBBやそもそも銀染色とかは、よっぽどタンパク量がズレてたりしない限り同じ細胞ライセートを回収して染めた所で大きな違いは見当たらないことが多いので。 レフェリーのコメントならば、質問の意図によって変わってくるかもしれません。特に意図がないなら簡単にやり直して通るならまあやればいいし、サンプルの準備が困難なら一般的な方法としてインターナルコントロールとしてGAPDHやHSPでそろっていることは確認してる、とコメントしても良いともいますが。ただ、最近の不正問題がらみもあるので、元フィルムというかエキスポーズした全体の写真は保存すべきなのは言うまでもないでしょう。 ちなみに自分も染色ならクリアファイルで空気が入らないようにパックして綺麗に画像化したら、基本的には捨てちゃうことが多いです。よっぽど重要なものでない限り。

(無題) 削除/引用 No.5144-3 - 2016/06/10 (金) 00:16:46 - エミ おお様 早速のコメントありがとうございます。 ポンソーは水ですぐに染色されたブロットが消えて（滲んで）しまいますが、おお様はどのようにしていますでしょうか？私は透明なクリアファイルにメンブランを挟んでスキャナーで画像を保存しています。 他に何かもっと簡便な方法をご存知でしたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.5144-2 - 2016/06/10 (金) 00:02:56 - おお なるだけ残そうとしています。トータルライセートならまだしも、フラクショネーションやいろいろなファクターが絡んでくることもあるので。

ウエスタンのローディングコントロールについて 削除/引用 No.5144-1 - 2016/06/09 (木) 23:39:04 - エミ JBCに論文を投稿したのですが、ポンソーやCBB染色はちゃんとやっているのかと指摘されました。 これまでローディングコントロールとしてはactinやGAPDHを使って確認してきましたが、それに加え、ポンソーCBBの写真も必要なのは少しよくわからないなと感じています。もちろんこれらのデータがあることでより正確にローディングされていることが示されるわけではありますが 皆さんは上記のブロット画像もデータとしてちゃんと残していますでしょうか？

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