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(無題) 削除/引用 No.5142-8 - 2016/06/11 (土) 16:06:32 - くぁwせdrftgyふじこlp；＠ 大杉です。血清の場合、血清1μl+SDS-sample buffer (1x)100μlで混ぜたものを5~10μl/laneで流してますが、それでもまだ少し多い感じです。ただ、それでは少なすぎて目指す蛋白質が検出できないこともあるとおもいます。それで、 たとえば、albuminが邪魔ならば、除去キットはいろいろ販売されているので、試してみて下さい。あるいはブルーセファロースみたいな色素の担体もalb除去に使えます。お金の面であれなら、硫安分画法してから透析するのがいいでしょう。IgGの除去ならprotein A and/or Gの担体を使えば出来ます。 ただ大事な事は、これらの方法はalbuminやigGだけを特異的に除去するという保証はなにもないことです。分画、精製過程で目指すものもいっしょに失われる可能性もあります。特に微量のものはおもわぬ事故で途中でどっかに行ってしまうことも起こりえます。

(無題) 削除/引用 No.5142-7 - 2016/06/08 (水) 13:55:47 - え？ >[Re:6] たていすさんは書きました : > 100%の血清を1ul（約1mg重量だろう）

(無題) 削除/引用 No.5142-6 - 2016/06/08 (水) 13:01:38 - たていす 100%の血清を1ul（約1mg重量だろう）使うと、そのうちの8%程度がタンパク質だとして、80ugほどタンパク質を加えていることになる？ sample-bufferのキャパに比べて多すぎない？？ それ以外に、アルブミンはDTTやｂ−MEでの処理が不十分（やっていない）だと、そのくらい分子量が変わることも有りますよ。

(無題) 削除/引用 No.5142-5 - 2016/06/08 (水) 12:16:39 - おお それか２Dするか。たしかにpIでアルブミンときれいに別れる保証はないけど。

(無題) 削除/引用 No.5142-4 - 2016/06/08 (水) 12:06:41 - おお 培養細胞のライセート を使って確かめるようですが、場合によってはうまく結論が出ないような気がします。例えばライセートと分泌されたもので分子量が違うとき、その差がさほど大きくなければアルブミンで押しやられて差がないようにみえるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5142-3 - 2016/06/08 (水) 12:02:36 - おお ＞アルブミン存在下で他のタンパク質の泳動にも影響があるのか、 ありえます。 何らかの方法で粗精製した方がいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.5142-2 - 2016/06/08 (水) 11:56:42 - fff 細胞の培養上清（10% FBS）などの場合も、アルブミンを中心にしてバンドが上下に押しやられて乱れることはよくあります。 もともと細胞内のタンパク質あるいは膜表面に存在するタンパク質で、血清中にも存在するということであれば、分泌されるためになんらかのプロセッシングを受けている可能性もあると思うのですが、そういう報告はないのでしょうか？

血清SDS-PAGEでのアルブミン存在によるMWの解釈に関して 削除/引用 No.5142-1 - 2016/06/08 (水) 11:32:51 - 血清PAGE 血清中にごく微量存在するタンパク質のwesternを行っています。 コントロールとしてはその分子のノックアウトマウスの血清です。 その分子は培養細胞のライセートでは55 kDaほどにbandを認めます。 一方、serum 1 ulを10% SDS- PAGEすると、その分子は40 kDaになりました。 もちろん翻訳後修飾やらで分子量が変わることも知っているのですが、そもそもポンソー染色すると、1 ulにもかかわらず当然アルブミンがどかんと出ますが、アルブミンでさえも45 kDaあたりを中心に大きく出ていました。 これらのことから、アルブミンがあるがために泳動パターンがおかしくなったため、40 kDaにbandを認めたとも考えられますでしょうか？ もちろんサンプルがそろいましたら、 Lane 1. 培養細胞のライセート 5 ul Lane 2. 血清 1 ul Lane 3. 血清 1 ul + 培養細胞のライセート 5 ul で流すことで、Lane 3の結果が全てを語ってくれるとは思いますが、結構キモの実験なので、サンプルが揃う前に皆さまのご意見を頂戴できればと思い質問させていただきました。 アルブミン存在下で他のタンパク質の泳動にも影響があるのか、というのが質問です。 宜しくお願い致します。

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