全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.5141-6 - 2016/06/08 (水) 13:09:54 - ぱいんあめ >同じ蛋白溶液は使いませんが、、、結晶化したやつを新たなバッファーで溶かすのです。豊富にあるものがサチュレートして優先的に結晶化するので不純物は溶液に留まる傾向があるので、結晶化して溶液と結晶を分けて、結晶を再溶解して使うのです。 なるほど，そういうことですか。どうしても治らないのであれば一度やってみたいと思います。 >外れたNiが還元されて色が付いた？ こちらに関してですが，溶出液にはDTT等の還元剤は入っていないので，考えにくいかと思います…

(無題) 削除/引用 No.5141-5 - 2016/06/08 (水) 12:14:54 - おお 中年さんの指摘していることも気になってたんですが、溶出のときにDTTなど過剰に入っているとニッケルが還元されて茶色くなります。あれってイオンから電荷を持たない金属になってるんでしょうかねぇ、、、、もしそうならブンブン遠心で回せば、、、だめかな。 ＞再結晶はやったことがないですが，同じタンパク質溶液を使うと同じような結果になる可能性があるかと思います… 同じ蛋白溶液は使いませんが、、、結晶化したやつを新たなバッファーで溶かすのです。豊富にあるものがサチュレートして優先的に結晶化するので不純物は溶液に留まる傾向があるので、結晶化して溶液と結晶を分けて、結晶を再溶解して使うのです。

(無題) 削除/引用 No.5141-4 - 2016/06/08 (水) 11:53:01 - 中年 外れたNiが還元されて色が付いた？

Re: detergents 削除/引用 No.5141-3 - 2016/06/08 (水) 11:19:13 - ぱいんあめ ありがとうございます。 濃縮方法に関してですが，10000カットのアミコンで濃縮しています。（タンパク質自体は40kDa程度です） タンパク質自体は無色であることがGST tagを用いた精製方法で分かっているのですが，そちらの精製では収量が非常に少ない状態です。 ＞この茶色の物質が原因で，タンパク質の結晶の質が悪くなることが予想されている この予想に関してですが，以前の精製ではこの茶色の着色が見られず，結晶が取れていたことが挙げられます。 その時点での差としては，Ni sepharose担体のロットの変更があります。 再結晶はやったことがないですが，同じタンパク質溶液を使うと同じような結果になる可能性があるかと思います… 培地の茶色いものの可能性があるので，M9 minimum mediumはアリかもしれませんね！試したことがありませんでした。Coカラムの追加も検討してみます。

detergents 削除/引用 No.5141-2 - 2016/06/08 (水) 10:50:44 - おお 濃縮方法はなんでしょう。 こファクターがついて色がついている蛋白がありますけどそのへんはどうでしょう。 ＞この茶色の物質が原因で，タンパク質の結晶の質が悪くなることが予想されている この予想はなんに基づくものでしょうか。 蛋白の結晶化でプラクティカルにどこまで有効はわかりませんが、その状態で結晶化して、得られた結晶をとかして再結晶するときれいになるというのはありますけど。 培地の茶色いのが抜けないならM9 minimum mediumとか使ってもいいかもです。クロンテックがCoなどをキレーとしてHis-tagを精製するカラムを売っているので、Ni sepharose(GE)で粗精製してから、Coカラムで精製するのも手かもしれない。

Ni sepharoseでの精製による不純物に関して 削除/引用 No.5141-1 - 2016/06/08 (水) 10:20:22 - ぱいんあめ タンパク質を精製する際に，Ni sepharose(GE)のアフィニティを使っています。 その後ゲル濾過を行っているのですが，そのフラクションを濃縮するとタンパク質溶液が茶色になっていることがわかりました。 このような経験をされた方はおられますか？ この茶色の原因となる不純物を除去するにはどうしたらいいのでしょうか？ 補足情報ですが，タンパク質自体は核酸合成関連のものです。 タンパク質自体が凝集しやすく，緩衝液に500mMのKClが入っています。 そのため，硫安沈殿やイオン交換すらもできない状態です。 この茶色の物質が原因で，タンパク質の結晶の質が悪くなることが予想されているので何とかしたいと考えています。 よろしくお願いします。

全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---