全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.5135-18 - 2016/06/07 (火) 01:54:56 - RNA初心者 >[Re:15] APさんは書きました : > バッファー飽和調製済みの核酸抽出用のフェノールは高価ですが、自前で調製すれば500 mL1000円もかからないですから、変なところでケチってトラブルを招くのは馬鹿らしいと思いますけどね。 自分も新規に調製したいと担当教員に言ったのですが、出来るはずだからと買っていただけませんでした。フェノールの調整はやったことあるので再度提案してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.5135-17 - 2016/06/07 (火) 01:51:38 - RNA初心者 >[Re:10] APさんは書きました : > ちなみにTrizolとかRNAzolのようなmonophasic reagentは経験上ずっと長期間もちます。なにか特別な安定剤が入っているのかグアニジンか何かの成分がスカベンジャーになっているのだとおもいます。RNA抽出用にその手の試薬を持っているなら、DNAase処理後の精製に使うのも可です。 その方法も明日試してみようと思います。フェノールに問題があれば、解決する可能性はありますね。

(無題) 削除/引用 No.5135-16 - 2016/06/07 (火) 01:49:57 - RNA初心者 >[Re:9] おおさんは書きました : > まあでもよっぽどひどいコンタミ出ない限り、全部没というのはなさそうなので、フェノールが一番怪しいですね。色が若干でも濃くなったり茶色っぽくなってませんか？ 綺麗な黄色ではなく少し赤みがかっていたので酸化しているような気がしていました。

(無題) 削除/引用 No.5135-15 - 2016/06/07 (火) 01:48:13 - AP バッファー飽和調製済みの核酸抽出用のフェノールは高価ですが、自前で調製すれば500 mL1000円もかからないですから、変なところでケチってトラブルを招くのは馬鹿らしいと思いますけどね。

(無題) 削除/引用 No.5135-14 - 2016/06/07 (火) 01:47:28 - RNA初心者 > あとrRNAが見えないと言っていますが、どうやって調べてますか？ > 非変性で泳動するとその時々の二次構造の取り方で泳動像は様々で、ちゃんとバンディングせずスメアになってもおかしくないです。最近、ここでもコメントしました。 > http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=5114 ホルムアルデヒド、ホルマリン、loading buffer、MOPSの混合液をRNA溶液に等量加え、65℃ ５分後に氷で急冷し、アガロースゲルで永動しています。

(無題) 削除/引用 No.5135-13 - 2016/06/07 (火) 01:43:50 - RNA初心者 >[Re:5] おおさんは書きました : > わたしはあり得ると思ってます。ま、それはともかくフェノール処理をするなら酸性フェノールのほうがいいかと思います。DNAを吸収してくれるので。RNaseAはディネーチャーしてもリネーチャーするというので有名ですね。 フェノールならリネーチャーされない解釈でした。たしかに熱では再び立体構造をとるということから、化学的修飾による不活性化でない限りRNaseはリネーチャーされると考えるべきでした。

(無題) 削除/引用 No.5135-12 - 2016/06/07 (火) 01:41:02 - RNA初心者 >[Re:4] APさんは書きました : > >4℃で１年以上保存したフェノールを用いている > > ありえなーい。 > 一ヶ月くらいが限度でしょう。長期保存するなら不活性ガス充填で密栓するか、フリーザーで保存です。酸化したフェノールはラジカルを生じ核酸を攻撃します。 やはり１年以上は問題ですか。担当教員に指摘したのですが聞く耳をもってもらえませんでした。フェノールの酸化について詳しく調べ、説明しようと思います。

(無題) 削除/引用 No.5135-11 - 2016/06/07 (火) 01:35:47 - AP >ただし、DNase処理後では問題ないとおっしゃってますので、確認する術は持っているのだろうと想像していますが DNase処理後はたまたま二次構造がひどくなくてrRNAのバンドが見えてたけど、フェノール抽出エタノール沈殿後はそうでなかったということが考えられます。 最近ノーザンとかがルーチンじゃなくなってきて、非変性だと基本的にバンディングしないということをわかっていない人やラボというのも珍しくなかったりするので。

(無題) 削除/引用 No.5135-10 - 2016/06/07 (火) 01:27:51 - AP ちなみにTrizolとかRNAzolのようなmonophasic reagentは経験上ずっと長期間もちます。なにか特別な安定剤が入っているのかグアニジンか何かの成分がスカベンジャーになっているのだとおもいます。RNA抽出用にその手の試薬を持っているなら、DNAase処理後の精製に使うのも可です。

(無題) 削除/引用 No.5135-9 - 2016/06/07 (火) 01:26:41 - おお まあでもよっぽどひどいコンタミ出ない限り、全部没というのはなさそうなので、フェノールが一番怪しいですね。色が若干でも濃くなったり茶色っぽくなってませんか？

detergents 削除/引用 No.5135-8 - 2016/06/07 (火) 01:24:02 - おお >わたしはあり得ると思ってます。 いやたぶんこれについての反論と思われますが、このありえるはRNAが酵素によって分解されいる可能性についてあり得ると言ってます。レスが被ってややこしくなりましたね。すいません。

detergents 削除/引用 No.5135-7 - 2016/06/07 (火) 01:22:19 - おお >[Re:6] APさんは書きました : > >おおさん > いや、1年もののフェノールを使用するなんてちゃんとわかっている人ならありえないと言っているのですが、通じてますか？ それはそうだと思ってますよ。ただし保存状況がわかりませんので。 > > あとrRNAが見えないと言っていますが、どうやって調べてますか？ > 非変性で泳動するとその時々の二次構造の取り方で泳動像は様々で、ちゃんとバンディングせずスメアになってもおかしくないです。最近、ここでもコメントしました。 > http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=5114 ただし、DNase処理後では問題ないとおっしゃってますので、確認する術は持っているのだろうと想像していますが。

(無題) 削除/引用 No.5135-6 - 2016/06/07 (火) 01:17:40 - AP >おおさん いや、1年もののフェノールを使用するなんてちゃんとわかっている人ならありえないと言っているのですが、通じてますか？ あとrRNAが見えないと言っていますが、どうやって調べてますか？ 非変性で泳動するとその時々の二次構造の取り方で泳動像は様々で、ちゃんとバンディングせずスメアになってもおかしくないです。最近、ここでもコメントしました。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=5114

(無題) 削除/引用 No.5135-5 - 2016/06/07 (火) 01:04:37 - おお わたしはあり得ると思ってます。ま、それはともかくフェノール処理をするなら酸性フェノールのほうがいいかと思います。DNAを吸収してくれるので。RNaseAはディネーチャーしてもリネーチャーするというので有名ですね。

(無題) 削除/引用 No.5135-4 - 2016/06/07 (火) 01:03:10 - AP >4℃で１年以上保存したフェノールを用いている ありえなーい。 一ヶ月くらいが限度でしょう。長期保存するなら不活性ガス充填で密栓するか、フリーザーで保存です。酸化したフェノールはラジカルを生じ核酸を攻撃します。 酸性フェノールは除タンパク質と同時にDNAをフェノール層に除いて、RNAを精製するためです。除タンパク質だけが目的であれば中性フェノールでもRNAに使用できます。

(無題) 削除/引用 No.5135-3 - 2016/06/07 (火) 00:25:32 - RNA初心者 >[Re:2] おおさんは書きました : > 化学的にはRNAは安定で、化学分野のひとはなんでそんなに慎重に扱っているのかわからないと言った人がいました。分解の大抵は何らかの酵素のコンタミかと思ってます。ただフェノールが悪くなっていると何か起こるかもしれません。私はDNase処理の後はクロロフォルムだけで処理してます。RNAはちなみにアルカリで分解します。 ご回答ありがとうございます。 RNAはあんまり安定性は高くないと思い込んでいました。 酵素のこんたみですか。自分もそれを疑っていたのですが結果的にあり得ないと思っています。入ってるとすればフェノクロだと思いますが、フェノクロにある酵素が可逆的であることはあるのでしょうか。 フェノールの酸化の関与の可能性も考えてみようと思います。可能であれば比較も行いたいと思います。 クロロホルムのみでの処理というのは勉強不足で知りませんでした。プロトコルを探して明日の朝一に試してみようと思います。 貴重なご意見ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5135-2 - 2016/06/07 (火) 00:03:31 - おお 化学的にはRNAは安定で、化学分野のひとはなんでそんなに慎重に扱っているのかわからないと言った人がいました。分解の大抵は何らかの酵素のコンタミかと思ってます。ただフェノールが悪くなっていると何か起こるかもしれません。私はDNase処理の後はクロロフォルムだけで処理してます。RNAはちなみにアルカリで分解します。

フェノクロによるRNAの分解について 削除/引用 No.5135-1 - 2016/06/06 (月) 23:55:05 - RNA初心者 いつも勉強させていただています。 初めてのトピック作製なので至らないところがあるかもしれませんがお許しください。 題名通り、RNAをフェノクロで処理をすると壊れる現象に困っています。 RNAはRNAisoで抽出し、分解が起きていないのは確認済みのものを使用しています。 フェノクロは一般的なフェノール:クロロホルム: イソアミルアルコール=25:24:1に調整したものを使用し、タンパクの除去が目的のため中性フェノールを使っています。 実験の流れは低分子RNAのRTｰPCRを行うため、DNase処理→フェノクロを行っています。 DNase処理をtotal 20 ulで行い、RNase free waterで400 ulにvolume up後(当初はDNase処理を200 ulで行い、そのままフェノクロしていましたが、RNAがリボソーマルが見えなくなるくらい分解したため、volume upする方法を試したところ分解が軽減されたためこっちで行っています)に等量のフェノクロを加え、30 secボルテックスし、遠心、上清を用いてエタ沈を行っています。 DNase処理での分解の可能性は反応液をそのままエタ沈し分解が起きていないのは確認しています。 さらにcRT-PCRによるRNA末端の特定(これで問題が明るみになった)を行ったところ、5末端から分解が起きていることが考えられました。 私の考えは中性フェノールを使用している為、pHがRNAの安定に適したもので無くなり分解が起きている、もしくは4℃で１年以上保存したフェノールを用いているためフェノールが酸化しているのではないかと考えています。 しかし、勉強不足のためなぜそれぞれで分解が起きるかは加水分解が〜とか曖昧なところしか分からず化学反応式までは分かっていません。 担当教員は分からないの一点張りで、自分で原因を突き止めて担当教員に説明しなければなりません。さらに実験が進まずデータがとれず困っています。 どうか、同じ現象を経験しこうしたら解決した、原因として考えられることなどあればアドバイスしていただけないでしょうか。

全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---