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トランスジェニックマウスのジェノタイピング トピック削除
No.513-TOPIC - 2012/05/12 (土) 04:11:51 - ち
目的遺伝子Aをとある遺伝子Bのプロモーター下流に挿入した
トランスジェニックマウスを他のラボから頂きました。
２組のプライマーセットを用いたマルチプレックスPCR
（プライマーは挿入遺伝子Aに対するセットと野生型の遺伝子Aに対するセット。
挿入遺伝子はエクソンのみなのでPCR産物のサイズが違う。）
でのジェノタイピングを勧められたのですが、
「ホモのマウスでは野生型のバンドが消えるはず」と言われました。
この理由がどうしても分かりません。
自分の理解では、挿入遺伝子Aは野生型の遺伝子Aに全く干渉しないはずなので、
このような事は起き得ないと思うのですが。
マウス提供者に問い合わせたところ、
「もともとPCRのプロトコルを作った奴がもう居ないので分からない」と言われました。
PCRプロトコルの作成者に問い合わせをかけましたがナシのつぶてです。
再度問い合わせをかける予定ですが、どなたか解説して下さる方がいらっしゃいましたら
幸いです。
　
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コメントありがとうございます 解決済み 削除/引用
No.513-7 - 2012/05/15 (火) 06:14:48 - ち
コメントありがとうございます。

＞直輝さま
理論上、仰るとおりなのですが、マウスそのものは文献として世に出ており、
そこの問題はもともとのマウス作成者が確認しております。
従って、ここでは問題点をホモかヘテロか、の点に限定させて頂きます。

＞AAさま
仰るとおり、「ノックインマウス」が表現として適切です。ご指摘ありがとうございます。
プライマーが「野生型遺伝子」に対して設計されている、と思い込んでいたので、
ご指摘の点に全く気付きませんでした。

未だ問い合わせに対する返答はありませんが、改めて２セット４つのプライマーを使用し、
マルチプレックスPCRを試みつつ、先方へも問い合わせを再度かけてみます。
完全に解決ではないですが、いったんこれでスレッドを閉じさせて頂きます。

再度になりますが、コメント頂いた方々、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.513-6 - 2012/05/14 (月) 12:11:05 - AA
ノックインマウスだとすれば置換されている配列に対するプライマーと挿入されている配列に対するプライマーの組み合わせでPCRすることはリーズナブルだと思います。
というか、たいていのノックインマウスではそうしているのでは？
例えば、
B遺伝子のプロモーターの3'末端領域　
　　　　　vs
遺伝子Bの開始コドン以降　or 遺伝子Aの開始コドン以降
という組み合わせでプライマーを設計すれば、
KI/KIのホモになった時にWTのバンドが出ないのは当然だと思います。
質問者さんの場合は4種のプライマーを用いていますが、
内在性遺伝子AのバンドがWTで出ないのは鋳型がcDNAで、イントロンを含めると長すぎるのでしょう。


蛇足になりますが、トランスジェニックマウスという表現は
ノックインやノックアウトなどのジーンターゲティングマウスと区別される場合があります。
広義には遺伝子組み換え動物のことを示すとは思いますが、もしかするとそのあたりで混乱があるかもしれません。
狭義でのトランスジェニックマウスの場合は挿入部位が不明なのでホモとヘテロをPCRで区別するのは難しいと思います。

(無題) 削除/引用
No.513-5 - 2012/05/13 (日) 04:31:12 - 直輝
＞トランスジーンに対するプライマーのみを現在使用しています。
＞子供をジェノタイピングすればそのマウスがホモかヘテロかの鑑別可能ですが

それだけではＢのプロモーター下流に入っているかどうか確認できないし、危険ですね。

それに、Ｂのプロモーター下流に挿入遺伝子Ａが入っていることが確認できたとしても、ゲノム内のどこかにもう１コピー挿入遺伝子Ａが入って、たまたま遺伝子Ｘをノックアウトしている可能性は否定できませんよね？

＞自分の理解では、挿入遺伝子Aは野生型の遺伝子Aに全く干渉しないはずなので

共通の配列なのだから、不幸にも野生型遺伝子も破壊している可能性はあるかもよ。

(無題) 削除/引用
No.513-3 - 2012/05/12 (土) 11:33:19 - ち
AAさん、コメントありがとうございます。

＞AのcDNAに対するプライマー＋B遺伝子座の被組換部位に対するプライマー
はい、その通りです。説明が不適切で申し訳ありません。

＞そもそも内在性AとトランスジーンAの組み合わせでPCRする意図がわかりません。
僕も分かりません。なので、トランスジーンに対するプライマーのみを現在使用しています。

もう少し追加で説明いたします。
もともと頂いたマウスはホモという触れ込みだったのですが、
表現型を見てみるとヘテロの可能性が考えられました。
そこで、マウスの提供元でどのようにホモ・ヘテロを見分けていたのか質問したところ、
上記の回答でした。

現在繁殖中ですので、子供をジェノタイピングすれば
そのマウスがホモかヘテロかの鑑別可能ですが、
可能であれば直接鑑別したい（そうでなければ実験系が組めない）と考えております。

引き続きコメントお待ちしております。

(無題) 削除/引用
No.513-2 - 2012/05/12 (土) 11:10:52 - AA
Bの遺伝子座にAのcDNAがノックインされたマウスということでしょうか？
だとすれば、

AのcDNAに対するプライマー＋B遺伝子座の被組換部位に対するプライマー

の組み合わせではないですか？
そもそも内在性AとトランスジーンAの組み合わせでPCRする意図がわかりません。

トランスジェニックマウスのジェノタイピング 削除/引用
No.513-1 - 2012/05/12 (土) 04:11:51 - ち
目的遺伝子Aをとある遺伝子Bのプロモーター下流に挿入した
トランスジェニックマウスを他のラボから頂きました。
２組のプライマーセットを用いたマルチプレックスPCR
（プライマーは挿入遺伝子Aに対するセットと野生型の遺伝子Aに対するセット。
挿入遺伝子はエクソンのみなのでPCR産物のサイズが違う。）
でのジェノタイピングを勧められたのですが、
「ホモのマウスでは野生型のバンドが消えるはず」と言われました。
この理由がどうしても分かりません。
自分の理解では、挿入遺伝子Aは野生型の遺伝子Aに全く干渉しないはずなので、
このような事は起き得ないと思うのですが。
マウス提供者に問い合わせたところ、
「もともとPCRのプロトコルを作った奴がもう居ないので分からない」と言われました。
PCRプロトコルの作成者に問い合わせをかけましたがナシのつぶてです。
再度問い合わせをかける予定ですが、どなたか解説して下さる方がいらっしゃいましたら
幸いです。
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