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(無題) 削除/引用 No.5123-19 - 2016/06/19 (日) 13:36:28 - ks 可溶化剤の件ですが、今回はn=1の予備実験で、異なる日に蛋白抽出したため、トランスフェクションしてから蛋白抽出するまでの時間にずれがありましたので、有意なものではないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5123-18 - 2016/06/18 (土) 06:44:18 - おお わたしもフィードバックがきけてよかったです。Lysisのバッファーでも若干違うってのは興味深いですね。逆手にちって膜が可溶化しない状況でLysateを取るというのもありかなぁ。。。なんて妄想してます。

(無題) 削除/引用 No.5123-17 - 2016/06/16 (木) 20:02:31 - AP フィードバックありがとうございます。 将来、あとに続く人たちの役立つでしょう。

(無題) 削除/引用 No.5123-16 - 2016/06/16 (木) 05:59:51 - ks サンプルに5M尿素を加えたところ、250kD以上のバンドはほぼ消失し、期待していた43kDに強いバンドが得られました。インキュベーションの条件は4℃でも20℃でも差はありませんでした。還元剤はβ-MEでもDTTでも差はありませんでした。細胞の可溶化剤はRIPA bufferよりは、細胞膜用のCell-LyEX MPの方が強いバンドが得られました。ゲルに5M尿素を入れるか入れないかはあまり影響ありませんでした。 皆さん親切にアドバイス頂きありがとうございました。お蔭さまで実験を成功させることができました。今後は私もアドバイスする側になれるよう精進したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.5123-15 - 2016/06/15 (水) 06:33:30 - Tips 膜タンパクで泳動中にアグってる？子が以前居ました。 変性温度、時間は最低限にして、まだアグリがあった時に、なるべく早く泳動中に高分子側が分離できるような泳動ゲルにして解決したことがあります

(無題) 削除/引用 No.5123-14 - 2016/06/09 (木) 07:22:38 - AP 4℃に固執しなくてもいいのではないですか。 尿素無しでは4℃の成績が良かったとしても、尿素が入ることで条件が大きく違っているはずです。

(無題) 削除/引用 No.5123-13 - 2016/06/08 (水) 23:54:47 - おお どのたいみんぐでもいいでしょうけど、アグル前に入れたほうがより良いとするならばなるべく早い時期に入れたいと言うのはあると思います。室温飽和で１０ー１２Mあると思うんだけど（物によっては室温で８Mで飽和すると書かれてたりしたような気も）、８Mでは冷やすと沈殿しますね。ウレアの沈殿は室温に戻すとすぐ溶解しますから、もし沈殿したなら室温でしばらく放置しておけばいいです。 いまサンプルバッファー中にあるサンプルがあるなら、それに加えて流してもいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.5123-12 - 2016/06/08 (水) 16:00:05 - ks >>おおさん ありがとうございます。 お伺いしたいのですが、尿素はどのタイミングで加えておられますでしょうか？サンプルにSDS、β-MEを添加した後、4℃で24時間インキュベートする予定なのですが、この時点で加えてもよいものでしょうか？低温ですと尿素が析出してしまう気がします。それともゲルにアプライする直前でよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5123-11 - 2016/06/07 (火) 21:26:31 - thermo >[Re:9] ANOさんは書きました : > RIPAバッファーよりも、T-perかM-perの方がよいのでは？ 根拠は？

(無題) 削除/引用 No.5123-10 - 2016/06/07 (火) 21:14:13 - おお 普段ゲルを作ってないのなら、サンプルバッファー中のサンプルに室温で飽和しているウレアを等量加えて室温で数分静置しておいてから流すといいかと思います。これで改善することは多いようですが、それでもだめならゲルに入れないといけないかもしれません。ゲルに入れた場合トランスファーが少し効率が落ちるかなぁって気がします。 ゲルを一度バッファーでインキュベーションした方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5123-9 - 2016/06/07 (火) 21:06:00 - ANO RIPAバッファーよりも、T-perかM-perの方がよいのでは？ 詳細は、 https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/cell-lysis-solutions.html 当方では、組織も細胞もT-perを使っています。

(無題) 削除/引用 No.5123-8 - 2016/06/07 (火) 15:39:30 - ks たくさんのアドバイスありがとうございます。 本日SDS-PAGEのサンプルのインキュベートを95℃×10分間→�@4℃×24時間、�A37℃×24時間、�B37℃×30分、�C60℃×30分に変更し、Western Blotを再トライしました。250kD以上の強いバンドは相変わらずでしたが、特に�@のサンプルで標的蛋白のサイズ(43kD)のバンドを認めました。見返してみると95℃×10分のサンプルでもうっすらバンドが見えておりました。バンドの強さから想定される蛋白量は250kD以上の部分が9割以上を占めておりますので、尿素を追加して再トライしたいと思います。サンプルだけでなく泳動ゲルにも尿素を入れた方が良いのか、もしご存じの方がおられましたら教えて頂けるとありがたいです。今のところ入れる予定ですが、入れる必要がなければ市販のゲルを使いたいと思います。還元剤はβ-MEを使用していますが、DTTも試してみます。

(無題) 削除/引用 No.5123-7 - 2016/06/06 (月) 05:28:53 - CCR 以前ここで、同じような問題でアドバイス（特におおさんとサンショウウオさん）から頂きました。ボイルをやめて4oCオーバーナイトでSDS化する事により、250kDaあたりのスメアがダイマーくらいのサイズまで下がりました。さらに、サンプルとゲルに尿素を加える事により、一部モノマーの位置にバンドが出るようになりました（ダイマーらしきバンドは残りましたが）。bMEとDTTでは、変わりがありませんでした。ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.5123-6 - 2016/06/05 (日) 10:04:49 - くぁswでfrgtひゅじこlp SDS-resistant なオリゴマーを形成しているのかもしれない。疎水性の強い蛋白質ではそういうこともたまにある。膜蛋白質ということなので棟鎖付加の可能性はないだろうか。Endoglycosidase Fなどで処理したら分子量は変化しないだろうか。高分子量化する修飾は他にも沢山ある。なのでFLAG抗体でIPしてある程度精製出来たら、LC-MS/MSで分析してみることを勧める。うまくいけば、修飾体の蛋白質とその結合部位が同定出来る。 SDSーPAGE はみんなが考えているほど正確に分子量を反映しないことがあるので、蛋白質のアミノ酸組成の偏りとか、修飾とかの要因で、理論値とはとんでもなく違う位置に泳動されるて来る事は実際にある。あまり「こうなるはず／こうでないとおかしい」と決めてかからないほうがいい。

(無題) 削除/引用 No.5123-5 - 2016/06/04 (土) 07:30:51 - サンショウウオ レムリバッファーを加えてから、ライセートの溶液が凍らないような温度（0℃以下）でオーバーナイトインキュベート。その後泳動したらGPCRで取れたことあります。 　これでも、ものによってはオリゴマーやなんか修飾されたバンドがでたりします。 　ボイルだめ、絶対。

(無題) 削除/引用 No.5123-4 - 2016/06/03 (金) 05:11:19 - mon 過剰発現が原因のポリユビキチン化かも。

(無題) 削除/引用 No.5123-3 - 2016/06/02 (木) 22:06:40 - ぺ You should not boil it.

(無題) 削除/引用 No.5123-2 - 2016/06/02 (木) 19:43:53 - AP 膜タンパク質は通常のSDS-PAGEでやるようにサンプルバッファー中で加熱（ボイル）してしまうと、アグリゲーションを起こしてしまうことが知られています。 SDS化のときに室温とか37℃など温和な条件で時間をかけて行うとよいと言われています。また、尿素を加えた系でやる人もいます。 この問題に関しても過去トピにたびたびあったと思います。

膜貫通型受容体のWestern Blot 削除/引用 No.5123-1 - 2016/06/02 (木) 19:10:19 - ks RIPA bufferでHEK293細胞から抽出したFLAG融合7回膜貫通型受容体(KISS1受容体)のSDS-PAGEよびWestern Blot(FLAG抗体)を行ったのですが、バンドが本来の位置よりもはるかに重いところに出てしまいます(本来43kDのはずが250kD以上に位置しておりスメアを伴うwideなバンドです)。細胞膜の可溶化が不十分である可能性を考え、可溶化剤を膜貫通型受容体用のCell-Lyex MPに変更しましたが、同じ結果でした。また、β-MEによる蛋白の変性が不十分である可能性を考え、β-MEに対する蛋白の添加量を1/10にしてみましたが、やはり改善ありませんでした。同受容体をトランスフェクションしていないHEK293細胞からの抽出蛋白(negative control)では全くバンドを認めませんので、同バンドがFLAG融合蛋白を反映しているのは間違いないと思います。ハウスキーピングのアクチンのバンドは予定通りの位置に認めますので、7回膜貫通型受容体としての性質が影響している気がします。ちなみに同受容体そのものの一次抗体は色々試したのですが、negative controlでもバンドを認めるなど良いものは得られませんでしたので、FLAG抗体を使用しています。膜貫通型受容体のWestern Blotは非常に難しいと伺ったことがあるのですが、ご経験がある方がおられましたらアドバイス頂けますと助かります。

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