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ありがとうございました。 削除/引用 No.5120-6 - 2016/06/09 (木) 11:28:16 - pandaglaphu 皆様、ご親切に助言していただきありがとうございました。 シングルコロニーを培養して確認いたしましたら、目的のものが増幅しておりました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5120-5 - 2016/06/02 (木) 23:54:08 - ねずみ > 制限酵素で一箇所切断して電気泳動で確認したところ、5ｋｂぐらいのところにきっちりバンドが出ておりました。これは明らかに短いです。 > 念のため制限酵素処理せずに電気泳動しても、短いバンドは確認されますので、制限酵素処理で出来た断片ではないようです。 何らかの理由で制限酵素がほとんど働いていなくてcccが見えているだけとか？

(無題) 削除/引用 No.5120-4 - 2016/06/02 (木) 13:45:03 - mon 頻繁に欠失が起こるようなら、菌株を変えると問題ないときがあります。 うちでは、DH10B（あるいはTOP10)、XL1Blue、NEB-Stableの3種を試す事が多いです。

(無題) 削除/引用 No.5120-3 - 2016/06/02 (木) 09:20:31 - おお シングルコロニーひろいましょう。入っていたプラスミドが切断されたりして組みかわるのかどうかメカニズムはよくわかりませんが、グリセロールストックから直接培養に移すと、特に長期期間の保存や大腸菌に負担がかかるプラスミドではお示しのようなことがよく起こります。シングルクローンを何個か拾って、オリジナルのプラスミドが保持されているクローンを見つけて、より大きいスケールに持っていくことをおすすめします。 それでもどうしてもリカバリーできないなら、グリセロールストックの大腸菌を回収してミニプレップしてそれをもう一度トランスポーメーションするという裏技もあります。とくにグリセロールストックから大腸菌が増えなかった場合はこの手しか取れません。

(無題) 削除/引用 No.5120-2 - 2016/06/01 (水) 21:53:11 - IP 液体培養で起こすよりはきちんとプレートに播種してシングルコロニーを拾ったほうがいいと思います。

プラスミドが縮小する？ 削除/引用 No.5120-1 - 2016/06/01 (水) 19:28:46 - pandaglaphu プラスミド（12kbぐらい）をDH5aで保存しておりまして、液体培養で起こしてプラスミドを抽出いたしました。 制限酵素で一箇所切断して電気泳動で確認したところ、5ｋｂぐらいのところにきっちりバンドが出ておりました。これは明らかに短いです。バンドはそれ以外にも複数あり、目的のものと思われる長さのバンドも薄っすらとですがありました。 念のため制限酵素処理せずに電気泳動しても、短いバンドは確認されますので、制限酵素処理で出来た断片ではないようです。これはプラスミドの複製過程でエラーが起こったのでしょうか？ 解決方法等、どなたか分かる方は居られますでしょうか。よろしくお願い致します。

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