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(無題) 削除/引用 No.5110-18 - 2016/06/10 (金) 10:30:06 - RAW+retrovirus Dear うんちょこちょこぴー Thank you for your information based on your previous experiment. I consider usage of PlatGP system, because Dr. T previously informed me the RAW cell have low expression of ectopic receptor CAT1, which is needed for infection via gp70(PlatE system). How did you overcome the low infection efficiency in RAW264.7 cell? Sorted by GFP?

(無題) 削除/引用 No.5110-17 - 2016/06/10 (金) 07:44:52 - うんちょこちょこぴー Based on my experiences, infection efficiency of retrovirus into monocytic RAW264.7 is quite trickey. I think most of the publication uses sorting of infected cells which are supposed to be highly biased population because of super-low infection efficiencies. I am not sure whether lentri system overcome this difficulties. >[Re:16] RAW+retrovirusさんは書きました : > 今更ですが、 > 一応御報告を。 > > GFPを入れたら、ちゃんと強く光る細胞を認めました。 > ですが、非常に割合が悪く、 > 贔屓目に見ても1%なかったです。 > ウイルスを作る際のPlatEへのトランスフェクション効率は70%くらいで、 > とても悪いわけではないと思いますので、 > ウイルスの出来がすごく悪いというわけではないと思うのですが。 > > それぞれの細胞を新しくして、 > 再トライしてみようかと思います。 > 少ないながら入っている細胞がいたので、 > PlatGPにしたほうがいいのか悩ましくなってしまいました。

(無題) 削除/引用 No.5110-16 - 2016/06/09 (木) 16:01:42 - RAW+retrovirus 今更ですが、 一応御報告を。 GFPを入れたら、ちゃんと強く光る細胞を認めました。 ですが、非常に割合が悪く、 贔屓目に見ても1%なかったです。 ウイルスを作る際のPlatEへのトランスフェクション効率は70%くらいで、 とても悪いわけではないと思いますので、 ウイルスの出来がすごく悪いというわけではないと思うのですが。 それぞれの細胞を新しくして、 再トライしてみようかと思います。 少ないながら入っている細胞がいたので、 PlatGPにしたほうがいいのか悩ましくなってしまいました。

(無題) 削除/引用 No.5110-15 - 2016/06/02 (木) 10:11:18 - RAW+retrovirus T様 ありがとうございます。 RAWではEcotropic receptorのCat1の発現が弱いかもしれない、 そのためPlatEなどのenv（gp70?）では感染できない可能性がある、 とのことですね。 VSV-Gだと感染可能な理由がよくわからなかったのですが、 検索すると、VSV-Gは細胞表面上の受容体に依存せずに、 脂質への結合と細胞膜の融合によって細胞内に侵入する、 との記載を見つけ、 Cat1が発現していなくても、 感染できるということなのですね。 まだ、GFPを発現させる検討を行なえていないので、 それがダメだった場合に、 GlatGPでトライしてみようと思います。 お金がないので、抗体によるチェックを行うかわかりませんが、 大変勉強になりました。

Ecotropic Receptorの発現確認 削除/引用 No.5110-14 - 2016/06/01 (水) 22:28:33 - T RAW264.7 cellは感染しないと聞いたことがあります。 感染しない理由はいろいろあるとは思いますが、一つにEcotropic Receptor (Cat-1)が発現していない／弱い可能性があります。 最近、BioLegendからFACS用anti-Cat-1抗体が出ましたので、これで発現確認してみてはいかがでしょうか？ EcoRが出ていない場合はVSV-Gを使ってみればいけるかもしれません。出ている場合はその他の理由でレトロは使えないという可能性大なのであきらめた方が…

(無題) 削除/引用 No.5110-13 - 2016/06/01 (水) 13:07:28 - RAW+retrovirus asan様　おお様 ありがとうございます。 ウイルスの濃度ですね。 Titerはちゃんと測っていないのですが、 １０ｃｍ1枚からとったものの半量を濃縮して突っ込んでいますので、 そんなに弱くはないと信じています。 次は全量つぎ込むつもりです。 RAWは増殖がとても速く、 分裂していないことはないでしょうが、 セレクション開始を（2〜）3日後に使用と思っています。 まず、GFPを見るつもりでいますが。 puroもhygroも濃度はいまだに悩んでいます。 弱いのも残ってしまう等を考えると、 若干濃くしたい気もするのですが、 濃すぎると耐性が入っていても死んでしまうらしいですし。 セレクションってもっとちょろいもんだと思っていました。 やっていることはシンプルなのですが、 意外と簡単にはいかないものですね。

(無題) 削除/引用 No.5110-12 - 2016/06/01 (水) 02:27:03 - おお ああ、そうですね。レトロの場合は分裂させないと入らないですね。

(無題) 削除/引用 No.5110-11 - 2016/06/01 (水) 02:23:19 - asan 何となく単純にウイルスtiterが弱すぎるのが問題という気もしますね。 個人的な印象では、ウイルス液を入りにくい細胞の場合は濃縮してしまうのが手っ取り早いです。 超遠心でなくても、6000gで16時間ぐらい4℃でまわせば濃縮できます。 レトロウイルスの場合は感染後の細胞分裂が重要なので、感染後2日ぐらいおいて増殖し始めてからセレクションした方が上手くいくと思います。 後は、ポリブレンの毒性が強いとか？接着細胞でもspinfectionしてしまう方が高濃度で短時間 でポリブレンを効かせる事も出来るし、入りにくい細胞には効果的な事もあります。 取りあえず検討するならこの辺でしょうか？ puromycin濃度の検討はすべきでしょうが、あまりに微妙な所で処理すると発現が弱いクローンとか 細胞のまき濃度のブレによって切れが悪くなったりもするので、注意も必要です。

(無題) 削除/引用 No.5110-10 - 2016/05/31 (火) 14:57:34 - RAW+retrovirus IP様 ありがとうございます。 やはり、入れますよね。 試薬の消費と手間で、 他の皆さんが省いているなら省こうかなと・・・。 大変参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.5110-9 - 2016/05/31 (火) 14:45:07 - IP レトロやレンチの場合にはなおさらのことselection薬剤は入れっぱなしの方がいいと思います。プロモータの不活化がよく言われているかと思います。 私の場合は、目的の遺伝子-IRES-EGFPをウイルスベクターで発現させていましたが、長期培養するとGFP陽性率の割合は減っていきましたので、何度かsortingをしていました。それでもダメな時はだめなのですが。参考まで。

(無題) 削除/引用 No.5110-8 - 2016/05/31 (火) 14:02:57 - RAW+retrovirus おお様 ありがとうございます。 セレクション試薬の濃度ですね。 確かにそこは荒っぽくしか濃度を振っておらず、 検討の余地はあると思っています。 実際、今puroは濃度の検討をしており、 半分の3ug/mLでもセレクションできそうかなという感触を得ています。 1ug/mLでは全く効かなかったので、 RAWではこの辺りと思います。 ですが、pSuperをRAWにレトロで入れている論文で、 puroを6ug/mL（同じ濃度）で入れていたので、 極端に問題ある濃度ではないとは考えています。 IP様 ありがとうございます。 RAWはTLRが動いて、感染が難しいとのことですね。 実際、そうなのかもしれません。 ですが、一応RAWにpSuperでshを入れた論文があるので、 難しいかもしれませんが、出来るのだろうと期待しています。 GFPを入れるポジコンの結果が気になりますね。 入ればよし、入らなかったら・・・とりあえずPlatGPかな。 そういえば、皆様は一度作製した安定発現細胞をいつまで使い続けますか。 Stockもして、ずっと使い続けるものなのでしょうか。 （細胞によるとは思いますが） 何継代までとか決めておられますか。 また、一度確立して以降もセレクション試薬を入れ続けておられますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5110-7 - 2016/05/31 (火) 12:36:54 - IP おぼろげな記憶ですが、RAW264.7はモノ、マクロファージ系の細胞なので、ウイルス感染させるとTLR (toll-like-receptor)などを活性化し、ウイルスを排除するようなシグナルが走ってしまうためにウイルス感染は難しいとどこかで聞いたことがあります。 なんにしても、ポジコンのウイルスがあればどこが悪いかわかりそうですね。

(無題) 削除/引用 No.5110-6 - 2016/05/31 (火) 12:20:43 - おお セレクションの薬剤の濃度は適切でしょうか？入り方、効率等によっては強すぎるとか言う場合もあるので、下げながら、同時に感染してない細胞を並行して処理して、完全にセレクションできる最低の濃度以上で増えればよしじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5110-5 - 2016/05/31 (火) 09:43:52 - RAW+retrovirus あ様 ありがとうございます。 GFPを発現するレトロを利用しての感染の確認は、 RAW細胞ではしていませんでした。 前述したものとは別のベクターのものしかないのですが、 確かに感染細胞が得られるかのいいコントロールになりそうですね。 GFPが3日たたないと見えるようにならないとかがもしあれば、 （RAWは遺伝子発現が遅いとかあるのでしょうか、もちろんないとはいえませんが） それ以降にセレクションをスタートしなければいけないことも、 わかるかもしれませんし。 また、レンチのシステムは現状では使えませんので、 できればなんとかレトロで行いたいと思っています。 ＶＳＶ−Ｇは、パントロピックなレトロを作製する際に使用されるエンベロープベクターでしたよね。 PlatGPがあったように思いますので、 それで試してみるのも一つですね。

(無題) 削除/引用 No.5110-4 - 2016/05/31 (火) 00:34:48 - あ 体分昔に同じようなことをした記憶がありますが、たしかにてこずったきがします。 ＧＦＰかなにかでＩｎｆｅｃｔｉｏｎを確認されましたか？ この細胞はＩｎｆｅｃｔｉｏｎしにくかったので最終的にはＶＳＶ−Ｇのシステムに変えたのを覚えています。 レンチとかはそこで使えますか？ >[Re:1] RAW retrovirusさんは書きました : > 度々参考にさせていただいております。 > RAW264.7へのretrovirusによる安定発現株の作製方法について、 > 相談させていただきたく、 > トピックを作成致しました。 > > RAW細胞にPlatEで作製したレトロウイルスを感染させて、 > セレクションをかけたのですが、 > 全ての細胞が死んでしまいました。 > > 具体的なプロトコールを示します。 > RAWを20x10^4/35mm dishでまき、 > 翌日に濃縮したretrovirusを感染させました。 > （plasmidはpSuperもしくはpBabe、濃縮はPEGを用い、ポリブレンを4ug/mLでいれてます) > さらに翌日、mediumを交換し、セレクションをスタートしました。 > （pSuperは6ug/mL puromycin, pBabeは200ug/mL hygromycin） > セレクション開始から4日間後、細胞がすべて死んでしまいました。 > （途中で一度、セレクション試薬有のメディウムに交換しています） > > なお、同時に別の細胞に全く同じウイルスを感染させてたところ、 > こちらの細胞ではちゃんと生き残る細胞が認められています。 > そのため、plasmidを含むウイルスはちゃんとできていると考えています。 > > RAW細胞にレトロウイルスでsh等を発現させて実験をされたことのある方、 > その他にもさまざまな点でSuggestionを頂ける方の、 > ご意見をお待ちいたしております。 > > よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.5110-3 - 2016/05/30 (月) 19:25:30 - RAW+retrovirus mon様 ありがとうございます。 濃度の検討は若干荒いですが、行いました。 セレクション２−３日後の観察では、 何もしていない細胞でも、 倍薄いだけで結構生き残っていて（きっとさらに死んでいくのでしょうが）、 どの濃度でセレクションをするのがいいのか、 若干不安になりますね。 セレクション開始日を遅らせるですね。 実は次にそれを試そうと思っていました。 感染2日後で行おうと思っていたのですが（今は1日後）、 3-5日後でどうかと提案いただいたので、 3日後で試してみようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.5110-2 - 2016/05/30 (月) 19:02:57 - mon 薬剤濃度はお使いのRAW細胞で検討しましたか？ 薬剤濃度が適切だとすると、選択薬剤を添加する日を遅くする（感染を０dayとすると3rd~5th day)と耐性細胞が得られることがあります。

RAW264.7へのretrovirusによる安定発現株の作製方法 削除/引用 No.5110-1 - 2016/05/30 (月) 18:40:32 - RAW retrovirus 度々参考にさせていただいております。 RAW264.7へのretrovirusによる安定発現株の作製方法について、 相談させていただきたく、 トピックを作成致しました。 RAW細胞にPlatEで作製したレトロウイルスを感染させて、 セレクションをかけたのですが、 全ての細胞が死んでしまいました。 具体的なプロトコールを示します。 RAWを20x10^4/35mm dishでまき、 翌日に濃縮したretrovirusを感染させました。 （plasmidはpSuperもしくはpBabe、濃縮はPEGを用い、ポリブレンを4ug/mLでいれてます) さらに翌日、mediumを交換し、セレクションをスタートしました。 （pSuperは6ug/mL puromycin, pBabeは200ug/mL hygromycin） セレクション開始から4日間後、細胞がすべて死んでしまいました。 （途中で一度、セレクション試薬有のメディウムに交換しています） なお、同時に別の細胞に全く同じウイルスを感染させてたところ、 こちらの細胞ではちゃんと生き残る細胞が認められています。 そのため、plasmidを含むウイルスはちゃんとできていると考えています。 RAW細胞にレトロウイルスでsh等を発現させて実験をされたことのある方、 その他にもさまざまな点でSuggestionを頂ける方の、 ご意見をお待ちいたしております。 よろしくお願い致します。

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