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(無題) 削除/引用 No.511-10 - 2012/05/16 (水) 13:02:43 - DMSO >Water(QIAGEN社製)を用いた とあるので、水は問題ないはずでしょう。PCR mix作成に使う水は別のものを使っているとかありますか？ もっとも、とにかくnegative controlのところでバンドが出るのだから、たとえメーカー製であろうと水からなにから全て疑ってかかるべきなのでしょうが。 コンタミに関する一般的な話） よく言われるのは、PCRをかける部屋（正確にはPCR mixを作る部屋）とゲルを泳動する部屋（ゲルを処理する部屋）を別にすること、というものですね。 キャップの蓋を開ける際にはオープナー（プラスチックで出来た栓抜きのようなもの）を使った方が良いかと思います。昔、同じくコンタミに困っていた後輩にオープナーを使うよう指示したところ、それ以来コンタミしなくなったということがあります。その後輩も「キャップは端しかさわっていない」と言っていました。 個人的に感じた話（勘ともいう）） おかしなバンドが出るプライマーセットがトピ本題に書いたもの以外にもあるとのことから、プライマーがコンタミしているように思います。おかしなバンドが出ないプライマーセットと出るプライマーセットを混ぜて、テンプレートDNA無しでPCRをかけてみたら判断できるかと思いますがどうですかね？ 全く横の話（門外漢なので、全く頓珍漢なことを言っていたら申し訳ありません） 50サイクルでやっと出てくるバンドって、信頼できるんでしょうか？それこそ、パラフィンブロックを作ったときにコンタミしたもの由来だったりするかも？ gDNAをテンプレートにしているとのこと、SNPsとか調べているんでしょうか? 50cycle回したら、例えproof reading ポリメラーゼを使っても増幅中にミスがでるような気がするんですが、それは問題にならないんでしょうか？ そういうわけで、トピ主さんの実験ではポジティブコントロールの置き方（バンドおよびその配列が、間違いなくそのパラフィンブロックからのDNA由来であることを証明する）も大事になってくると思われます。

(無題) 削除/引用 No.511-9 - 2012/05/15 (火) 18:13:43 - う 今更ですが、、、 ネガコンを用意するときに すべて新品にしてもバンドが出現するとありますが Waterが新品とは、どういうことなのでしょうか？ ボトルに詰められて販売されている水を購入していて 新たに開けて試しても、ということでしょうか？ そうでなかったら、そもそも純水機からの水が 既に何かを含んでいるということはないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.511-8 - 2012/05/15 (火) 09:23:43 - ンンノ 微量なDNAの増幅は環境からのコンタミがかなりシビアに効いてくるようです。 安全キャビネットやクリーンベンチなどUV灯でDNAを雰囲気中のDNAを破壊できる ベンチで仕込み作業をするといいと聞いたことがあります。 後は他人の作業を見ていて思うことがあったのは、反応液の調製時にチューブを 真上から覗きこむようにして作業する人が時々居ます。そういう人は自分から の落下物（フケとか）がコンタミの原因になりえます。

アドバイスありがとうございます！ 削除/引用 No.511-7 - 2012/05/14 (月) 14:35:54 - めばえ シークエンサーではないですが、パイロシークエンサーで配列の一部を確認したところ、ゲノムと同様の配列が確認されました。 ということはprimer dimerではなく、ゲノムDNAのコンタミということになるでしょうか？ eppendorfの営業担当の方と話をする機会があり、 ピペットからのコンタミとそれ以外からのコンタミを確認するために、 eppendorfのフィルターチップを使用するよう提案されました。 （自社製品のPRもあるのでしょうが、他社のフィルターチップのフィルタより目が細かいそうです） ＞PCRチューブのキャップの裏に、親指を介してコンタミというケースも考えられます。 PCRチューブのキャップは端しか触らないようにして、mixを作るチューブもスクリューキャップのものを使用してます。作業はグローブをして行っております。 コンタミするようになってからはできるだけ注意を払っており、 ネガコンにバンドが現れるのが5種類のprimer set中のproductサイズが100bp以下の3種類に限られており、サイズとコンタミに何か関係があるのかと思っています。 少しでも何か気がついた方がいらっしゃいましたらご教示ください。 お手数ですがよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.511-6 - 2012/05/14 (月) 13:09:50 - ~ ラボにシークエンサーがあれば、 サブクローニングして配列を読むのが解決への近道だと思います。

(無題) 削除/引用 No.511-5 - 2012/05/14 (月) 12:30:37 - されどPCR PCRチューブのキャップの裏に、親指を介してコンタミというケースも考えられます。

ありがとうございます！ 削除/引用 No.511-4 - 2012/05/14 (月) 12:22:01 - めばえ ご丁寧なご回答をありがとうございます。 ゲルは2.5%アガロースゲルを使用しております。 ヒトサンプルと同様にネガコンに目的のproductサイズ(74bp)が出てしまうのですが、 dNTPやprimer dimerでそのようなことが起こるのでしょうか？ チップはCorningのフィルター付きチップを使用してます。 フィルター付きのものを使っても、コンタミするのでしょうか？ パラフィンブロックより抽出したDNAを使用しているため、DNAの断片化が多く、 50サイクルでようやくバンドが確認できる感じです。 再びの質問で申し訳ありません。 アドバイスいただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.511-3 - 2012/05/14 (月) 12:07:23 - ンンノ 実験室の環境によっては、フィルター付きチップを使わないと微量のゲノムDNA のコンタミを回避できないことがあります。 それと５０サイクルも回さないと目的の産物が増えないんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.511-2 - 2012/05/12 (土) 14:58:12 - ag 電気泳動には何を使われていますか？アガロースゲル？ポリアクリルアミドゲル？キャピラリー？ 解像度が低いと、プライマーダイマーや余剰のプライマーやdNPTsが100 bp以下のところに見えてしまう場合があります。

PCRのnegative controlに出るバンドについて 削除/引用 No.511-1 - 2012/05/11 (金) 20:43:34 - めばえ PCRのNegative Controlに出るバンドについての質問です。 以下のprimerとABI社製のAmpliTaq Gold 360 polymeraseを用いてPCRを行っております。 templateはヒトのgDNAです。 試薬組成はABI推奨のprotocol通りに行っております。 annealingは57℃で30秒、サイクル数は50です。 PCR product:74bp GCCTGCTGAAAATGACTGAA（Tm:57.45　ABI「TM Calculator for PCR Primers」） TATCGTCAAGGCACTCTTGC（Tm:57.48　ABI「TM Calculator for PCR Primers」） PCR後電気泳動にてバンドを確認すると、ヒトのgDNAサンプルにもtemplateにWater(QIAGEN社製)を用いたNegative Controlにも74bp付近にバンドが確認されます。 Water含め試薬・チップ・チューブは全て新品を使用し、primer自体も合成メーカーで希釈してあるものを使用してPCRし直しても、Negative Controlにバンドが出てしまいます。 primer dimerがと思ったのですが、F,Rともに20merのprimerを使用して74bpのところにバンドが出るものなのでしょうか？ コンタミ以外に原因があったとして、何か考えられることはあるでしょうか？ 何かアドバイスいただけると幸いです。 よろしくお願いいたします。

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