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(無題) 削除/引用 No.5107-15 - 2016/06/07 (火) 22:36:10 - おお 思い出したので、ついかします。0.1%SDS単独の状態ではSDSが沈殿しやすく扱いが難しくなるかのしれません。たかいpHでは沈殿しにくいようですが。

(無題) 削除/引用 No.5107-14 - 2016/06/06 (月) 06:59:27 - おお SDS単独で0.1%の条件はどうだろう、、、ちょっとやる勇気がないですね。。。

(無題) 削除/引用 No.5107-13 - 2016/06/06 (月) 06:57:30 - おお RIPAはRadioimmunoprecipitation assay buffer の略で要するにIPバッファーなのですが、その組成にSDSが入ったものがあります。 http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/4/pdb.rec10617.short SDSが0.1%入っていても他の界面活性剤と共存することで、強い変性効果が発揮されないようでして、IPでもつかえる（抗体の活性がある）と言われています。もちろん抗体によっては抗原との相互作用が弱くなってしまう可能性は否定できませんが、この条件で使える抗体は結構あります。このことを利用して、SDSを入れて変性させて0.1％の終濃度で上記のRIPAの組成になるように希釈することでIPできる環境ができるということです。 じっさいにこの手法はユビキチン化した蛋白をIPしてユビキチン化を証明するのに使われています。変性していない場合、ユビキチン化したある蛋白があなたのターゲットの蛋白とコンプレックすを取っているだけであなたの蛋白がユビキチン化しているわけでない可能性を否定できません。 またChipアッセイでもSDSで変性、RIPAバッファーの組成になるように希釈という方法を取っていることが多いと思います。 文献はすぐ引き出せそうにないので、興味がありましたらそれぞれのキーワードなどで検索してみてください。

(無題) 削除/引用 No.5107-12 - 2016/06/06 (月) 03:08:45 - 横 興味深く拝見しております。 RIPAバッファーがSDSを中和？不活化するというのはどこ情報ですか？これって、単にPBSで希釈したらあとから加える免疫沈降用の抗体は働け無いんですか？

(無題) 削除/引用 No.5107-11 - 2016/05/31 (火) 15:27:29 - おお 解決の糸口がつかめましたね。 室温でのIPですが、確かに変性をかましているので、プロテアーゼの大部分が失活しているだろうと思いますが、個人的には１００％かととわれると明確にYesといえないので（renatureとか）、４度でやっているのがたいていです。もう一つの懸念は比較的しっかりとした界面活性剤を使っているので（Tweenほどよわくない）、温度を上げると界面活性剤の作用も強くなるだろうと思えます。ただ完全にダメだという話でもないので、余裕があるなら条件検討に加えてもいいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5107-10 - 2016/05/31 (火) 13:06:43 - IP 大変恐縮なのですが、解決できそうなので、どのように克服したかシェアさせていただきます。 まず、一番初めに問題として、 目的のタンパク質をIPしたのち、そのタンパク質の糖鎖修飾を見たいが、そもそも IPできない。どうしよう？です。 そこで過去スレッドにあった、まずSDSでタンパク質を変性させたのち、その後RIPA bufferで希釈し、そこへIPに使用する抗体を加えるというものを試してみました。 まずその条件検討として、以下のことがわかりました。 ・かなりの高濃度SDS存在下（終濃度10%でも）であってもGoat IgGはProtein G beadsに結合できる ・終濃度1.67%, 0.56%または0% SDS存在下で95度、3分煮沸してタンパク質を変性後、RIPA bufferで10倍に希釈して、その後IP用の抗体を投入して2時間、4度でローテーション後、 Protein G beadsをさらに加え入れ一晩4度でローテーション後、PBS-Tでbeadsを数回洗浄後、非還元SDS-PAGEを行うと、0% SDSでは目的のbandは見えず、SDS存在下では目的のbandが検出された。またこの時control IgGでは何もbandは見えなかった。 以上がこれまでのプログレスになります。結論として、SDSで変性させればIPができるようになるということでした。本当にありがとうございました！！ これから本番に移れますが、その前にもう少し条件検討してもいいのかなと思っています。 というのも、SDSで変性してしまえば、混在するproteaseも変性されるでしょうから、わざわざ、4度で一晩抗体とProtein Gでローテーションする必要もないかもしれないなと思っています。 これを室温でやっても一般的に問題となりませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5107-9 - 2016/05/31 (火) 12:56:32 - IP >[Re:6] SPさんは書きました : >個人的には2MEを入れてIPした経験がなく、抗体の機能を保持したまま目的タンパクの構造を崩すのに、どのくらいの量の2MEを入れるのか、ちょっと興味があります。 私も時間があれば、2MEの最小許容量を決めてみようと思っています。その際にはシェアさせていただきます。 > もう一点気になるのは、その分泌タンパクは通常の分泌経路で細胞外に出てくるのか、あるいはエクソゾームなど膜に囲まれた構造内のタンパクとして分泌されるのか、という点です。後者の場合は、培養上清にサンプルバッファーを入れて溶かしてからウエスタンすれば容易に検出できますが、培養上清に直接抗体を入れてもIPできないと思われます。培養上清をdetergentが入ったバッファーと混ぜてからIPすれば、この問題は解決すると思います。 なるほど！！エクソソームは考えたこともありませんでした！！確かに膜に包まれていますもんね。可溶性タンパク質であればエクソソーム内になるので抗体がアクセスできませんね。 一度デタージェント有無で比較することも大事ですね。ありがとうございます！！

(無題) 削除/引用 No.5107-8 - 2016/05/31 (火) 12:52:33 - IP おお様、 ありがとうございます。 還元、非還元SDS-PAGEではどちらもこの抗体はワークしていることは確認していますが、このタンパク質が複合体を作っており、2MEによって複合体中の当該分子に抗体がアクセスできるようになる、という可能性に関しては考えていませんでした。おっしゃる通りです。 asan様、ありがとうございます。 細胞を3割ほどのconfluencyにて6-well plateにまき、翌日PBS (+)にてリンス後、Opti-MEM1培地に置き換え（2 ml）、3日培養しました。3日目の細胞のviabilityは問題ありません。 上清を回収し、遠心でデブリなどを除いたのち、amicon spin colomn（10 k cut-off）にて2 ml -> 0.2 mlまで濃縮しました。確かにこの時点で濃縮したタンパク質に活性があるかはわかりません。また濃縮で、変性するようなタンパク質もあるんですね。 > FLAGやHisタグ付きの過剰発現細胞なんかで、一度FLAGとその抗体でIPできるかどうか確認するのもありかなとは思います。過剰発現の場合は、濃縮しなくてもメディウム量を減らして24時間ぐらいで上清から回収できることは多いので。 なるほど、まずはタグ付きでのIPで検討するのがまず第一に行うことなんですね。 確かにIPってトリッキーですもんね・・うまくいけばいいですが、いかない時にどこを改善すべきか逡巡するところですが、タグ抗体と目的の抗体でのIPというのは正攻法になりますね。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5107-7 - 2016/05/31 (火) 12:43:07 - IP たていす様、 返信が大変遅れてしまい申し訳ありません。変性させたのちの IPがまさかの大成功でしたので、シェアさせてください。 > 失礼ですが、１次抗体なしでブロットするともちろんシグナルはないのですよね？ １次抗体なしでのブロットはしたことがありませんが、ノックアウトのサンプルではbandは見えませんので、特異的なbandとの認識でした。 > ２）IPの前例があるのであれば、その追試から始めるのが良いだろうと思います。 > ＞この抗体を用いて、、、、、、をIPにて検出したりなどが多くの研究室にて > その研究はあなたの研究と同じ実験動物（マウス？）の抗原を用いて行われているのでしょうか？分泌タンパク質の中には、思いの外に種差の大きいタンパク質があると感じます。種特異性の差がIPされやすさに現れている可能性はないのでしょうか？ おっしゃる通りです。まずは先行論文を追試する形で始めましたが、再現できませんでした。 私自身IPの成功経験がそれほどないために先行論文があやしいのか、私の手技がおかしいのか判断できかねていました。分泌経路に入っていると糖鎖修飾のされ方も細胞ごとで異なるということですね、ほんとですね。今更その重要性に気づきました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5107-6 - 2016/05/30 (月) 20:11:51 - SP 似た実験をやってますが、分子内SS結合による立体構造化により、nativeのタンパクではエピトープが認識できない場合が結構あります。IP可とうたっている抗体でも、C末にタグをつけてタグの抗体で落とした場合と比べIP効率が非常に低くて困った経験が何回かあります。この可能性についてはおおさんから既に指摘されていますが、個人的には2MEを入れてIPした経験がなく、抗体の機能を保持したまま目的タンパクの構造を崩すのに、どのくらいの量の2MEを入れるのか、ちょっと興味があります。 もう一点気になるのは、その分泌タンパクは通常の分泌経路で細胞外に出てくるのか、あるいはエクソゾームなど膜に囲まれた構造内のタンパクとして分泌されるのか、という点です。後者の場合は、培養上清にサンプルバッファーを入れて溶かしてからウエスタンすれば容易に検出できますが、培養上清に直接抗体を入れてもIPできないと思われます。培養上清をdetergentが入ったバッファーと混ぜてからIPすれば、この問題は解決すると思います。 過去の論文のpulse chaseの実験が、培養上清を可溶化しないままIPして行われているのであれば、このような可能性は考える必要ないですが、もし細胞のライセートでpulse chaseしているのであれば、一考の余地があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5107-5 - 2016/05/28 (土) 17:47:58 - asan 過去にIPをしてる論文があるなら、エピトーブはたぶん問題ないと思います。 気になるのは、「10xに上清を濃縮した」とのことですがこの辺の操作はどうやってるのかな〜ということでしょうか。ウエスタン可能であっても、濃縮で変性したりすることは当然あるでしょう。あと、無血清培地で3日培養ってのが長い気がするんですが、細胞の状態は大丈夫ですかね？　 FLAGやHisタグ付きの過剰発現細胞なんかで、一度FLAGとその抗体でIPできるかどうか確認するのもありかなとは思います。過剰発現の場合は、濃縮しなくてもメディウム量を減らして24時間ぐらいで上清から回収できることは多いので。

(無題) 削除/引用 No.5107-4 - 2016/05/28 (土) 15:35:24 - おお エピトープが何らかの原因で隠れているなら、２MEを少し入れたりするのもいいかも。

(無題) 削除/引用 No.5107-3 - 2016/05/28 (土) 15:15:18 - たていす 抗原と抗体名を晒せないのでしょうから、一般的な議論ということですよね。 有名どころの古典的な抗体であれば、抗血清でIPも（きっと）うまくいくのでしょうが、抗血清でIPするのはなんとなく難しそうに思います。 １）そもそもウェスタンで見えているのが抗原なのかという点に関して、 ＞ライセートをinputとして流すと強いbandがIP前に出ていますし、 失礼ですが、１次抗体なしでブロットするともちろんシグナルはないのですよね？ ２）IPの前例があるのであれば、その追試から始めるのが良いだろうと思います。 ＞この抗体を用いて、、、、、、をIPにて検出したりなどが多くの研究室にて その研究はあなたの研究と同じ実験動物（マウス？）の抗原を用いて行われているのでしょうか？分泌タンパク質の中には、思いの外に種差の大きいタンパク質があると感じます。種特異性の差がIPされやすさに現れている可能性はないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5107-2 - 2016/05/28 (土) 13:39:09 - IP すみません。最後から数行上の文章に誤字がありました。 海面活性剤ではなく、 界面活性剤です。 申し訳ありません。

免疫沈降がうまくいきません。 削除/引用 No.5107-1 - 2016/05/28 (土) 13:35:10 - IP 大変初心者的なことなのですが、周りに聞ける環境がないために質問をさせてください。 この度、初めて免疫沈降に取り組んでいます。 抗体はサンタクルズ社より購入したヤギ抗血清です。細胞外への分泌タンパク質を認識します。 この抗体を用いた実績は数多くの論文で証明されているように思いますが、私が培養上清をウエスタンブロットした際には全く落ちてきていないようです。 抗体の特異性に関しては、研究室が所有するノックアウトマウス由来の細胞を無血清培地で培養した上清では検出されないこと、WTマウス由来の細胞の培養上清で強いバンドがでることをもって、特異的だと考えています。 パブメド検索すると、この抗体を用いて、pulse chase実験が行われており、新生されたタンパク質をIPにて検出したりなどが多くの研究室にて行われています。 これらの情報から、この抗体でIPできるはずと考えています。 ＊ただし同じロットかどうかまでは論文に記載がないのでわかりません。 また、プロテイン A/G混合ビーズでは投入したほとんどの抗体がビーズと結合していることは確認済みです。この抗体のウエスタンでは、ライセートをたった1 ugのせただけでも目的のバンドを強く出すくらいのいい抗体です。 条件を以下に記しますので、誤っているところ、改善の余地がありましたらご指摘いただけますととても嬉しいです。 細胞を無血清培地（Opti-MEM1）で３日培養し、その上清を10xに濃縮したのち、500 ulの濃縮上清に200 ug/mlの濃度の抗体溶液10 ul (2 ug IgG) を加え、4℃、一晩転倒混和したのち、プロテインA/G混合ビーズ（サンタクルズ社）をpacked volumeで10 ulほど入れ、再び4℃、1時間転倒混和したのち、0.05% Tween 20 in PBS (以下、PBS-T)で2度洗浄し、ビーズを 2x Laemuli SDS sample bufferで3分煮ています。 投入したIgGは全てプルダウンされています。 ライセートをinputとして流すと強いbandがIP前に出ていますし、プルダウンされなかった上清にも強く出ています。 以上のことから、抗体がIPしていないのだと考えています。 この実験の目的は、IPしたのち、そのタンパク質の糖鎖修飾をレクチンブロットにて検討するとことです。 IPの際に投入する抗体の量は500 ulに対して2 ugは総じて少ないのでしょうか？ 以前に試しで4 ug (20 ul) や5 ug（ 25 ul）を加えてみましたが、それでも全く落ちてきませんでした。 この過去のフォーラムで書き込みのあった、培養上清にSDSを低濃度加え、煮沸後、 プロテアーゼ阻害剤入のPBS-Tで希釈してからIPも試そうとは思っています。 ＊ウエスタンではごく低濃度のライセートに対してもこの抗体は強くバンドを出しますので、変性タンパク質をより認識しているのかなと期待しています。 この方法は試す価値があるとは思いますが、それ以外にも工夫する点（IPの際の塩濃度や海面活性剤の添加の是非）についてもありましたら、ご指摘いただけますと嬉しいです。 大変初歩的な質問で恐縮ですが、IPは全くの初めてですので、どうか宜しくお願いします。

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